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訂正 削除/引用 No.3306-6 - 2014/08/20 (水) 12:43:24 - mlck ×　RNA濃度が同じなので、〜 ○　RNA濃度が同じなのに、〜

(無題) 削除/引用 No.3306-5 - 2014/08/20 (水) 12:40:23 - mlck RNAの濃度を揃えていると思いますが、内在性コントロールとしたい遺伝子の発現量は8検体全てでだいたい同じですか？ RNA濃度が同じなので、Real timeのグラフの立ち上がり時期がずれているとしたら、それは内在性コントロールとして不適当だと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.3306-4 - 2014/08/20 (水) 01:18:02 - おお インターナルコントロールの変動はいつも意識しておくべきかと思います。 たとえば厳密に同じようにRTができているとして、インターナルコントロールをかいさずに差を見るとどんなことがいえるか見てみるといいかもしれません。 あとデーターをどの様に利用するかで有意差ふくめどのようにoutputを表現するのかもかわってきます。 いまのところこちらのコントロールのばあい、もうひとつのコントロールの場合と併記でまとめておけばいいかもしれませんけど。

(無題) 削除/引用 No.3306-3 - 2014/08/19 (火) 23:11:01 - ポスドク妊婦 >[Re:2] おおさんは書きました : > 有意差がないといってもいろいろなパターンがありますので答えに困ります。 おおさんすみません、説明不足でした。 同じ疾患の患者から4検体、同世代の健常人4検体で最低2回実験を繰り返して調べています。キットは、RTにHigh-Capacity cDNA RT Kit、PCRにはTaqMan Gene Expression Assay(18sとGAPDHにはVIC_PL)とMaster Mixを使用して、有意差の検討にはStudentのt検定を行っています。 いくつかの遺伝子発現を見ていますが、例えば内在性コントロールが18sでは有意に上昇している遺伝子が、GAPDHを内在性コントロールにした場合は、ほとんど差がなくなってしまうものがあります。 過去の投稿を読んだところ、定量PCRには、複数の内在性コントロールを使って検討した方がよいとありました。 もちろん両方のコントロールでも同じように有意差を持って上昇、下降している遺伝子もあります。 単純に、この疾患では18sやGAPDHも変動している可能性があると考えればいいのでしょうか？ それとも実験法に問題ありでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3306-2 - 2014/08/19 (火) 22:09:02 - おお 有意差がないといってもいろいろなパターンがありますので答えに困ります。

Real time quantitative-PCRにおける内在性コントロール 削除/引用 No.3306-1 - 2014/08/19 (火) 19:04:10 - ポスドク妊婦 現在妊娠中のポスドクです。 患者と健常人のサンプルから抽出したtRNAを使って、Real time quantitative-PCRの△△ct法で遺伝子発現を比較しています。 内在性コントロールとして、18sRNAとGAPDHを使用しているのですが、結果が両方とも同じ傾向を示す遺伝子と、片方は有意差なしだったりする遺伝子があるのですが、両者で結果が異なる場合は、どういった原因が考えられるのでしょうか？ ミーティングでボスから質問されたのですが、うまく答えられずに困りました。 詳しい方がいらっしゃいましたら、アドバイスよろしくお願いいたします！

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