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(無題) 削除/引用 No.3302-13 - 2014/08/19 (火) 22:06:08 - おお >[Re:12] 初心者さんは書きました : > おお様、mon様 > ご回答ありがとうございます。 > もう一種類、免染用に購入したモノクローナル抗体がありますので、challengeしてみようかと思います。 WBで使えるか一応チェックしてください。 > ご質問に関しては私の知識があやふやのため不十分であればご容赦ください。 > マウスはトランスジェニックマウス（CAGプロモーター）を用いています。 > 培養細胞はプラスミドをFugeneHDという試薬を用いてトランスフェクションしました。 > トランスジェニックマウスは外注してしまい、おそらく全く同じではないかと思いますが、私自身がちゃんと理解しておりません。 ちゃんとしらべなさん。結論が出せませんよ。

(無題) 削除/引用 No.3302-12 - 2014/08/19 (火) 16:11:55 - 初心者 おお様、mon様 ご回答ありがとうございます。 もう一種類、免染用に購入したモノクローナル抗体がありますので、challengeしてみようかと思います。 文献ももう少し調べてみたいと思います。 ご質問に関しては私の知識があやふやのため不十分であればご容赦ください。 マウスはトランスジェニックマウス（CAGプロモーター）を用いています。 培養細胞はプラスミドをFugeneHDという試薬を用いてトランスフェクションしました。 トランスジェニックマウスは外注してしまい、おそらく全く同じではないかと思いますが、私自身がちゃんと理解しておりません。申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.3302-11 - 2014/08/19 (火) 00:25:13 - おお 過剰発現ときいたので、トランスジェニックマウスとかエレクトロポレーションでプラスミドを組織に導入したとか、ウイルスベクターを感染させたとか想像してます。なのでコンストラクトのorfが全く同じかなとちょっと思ったふしはあります。

(無題) 削除/引用 No.3302-10 - 2014/08/18 (月) 15:15:43 - mon 追補２：すいません、修正出来ないので。 「過剰発現」とは、正確には正常な範囲を超えて発現した状態ですね。例えば、がん細胞ではEGFRが過剰発現していることが多い、などの表現を使います。 そのため、No.3302-8 の過剰発現とは、「強制的(人工的）な過剰発現」の意味です。

(無題) 削除/引用 No.3302-9 - 2014/08/18 (月) 15:12:06 - mon 追補：強制発現とも言います。こちらの方が使い方として正確かな。

(無題) 削除/引用 No.3302-8 - 2014/08/18 (月) 14:46:21 - mon 用語の使い方で、おおさんとすれ違いがあるような？？ 「過剰発現」とは、通常、intronのないタンパクコード領域(CDS)を含むDNA(mRNA由来ならcDNA)をウィルス由来promoterなどの下流に繋いだ発現ベクター（外来遺伝子とも言う）を、細胞に導入し、人工的に目的タンパクを多量に（正常値以上に）発現させることを指します。 肝臓での過剰発現は、どのように行ったのでしょうか？外来遺伝子を使わず、何か薬品等で刺激して、「発現誘導」したのでしょうか？ このような場合はゲノム上の遺伝子から発現しますので、使用するpromoterが異なったり（例えばintron3内にあるpromoterとか）、altanative splicingが起きたりして、異なるexonを含むCDS由来のタンパクが発現することがあります。 まあ、おおさんが指摘しているように「modificationの違い」を疑いますけど。 tunicamycinで糖鎖付加を阻害すると、新規に合成されたタンパクはアミノ酸だけのpolypeptideのサイズで検出されますよ(そのため処理時間によっては、糖鎖付加されたタンパク「も」検出される）。

(無題) 削除/引用 No.3302-7 - 2014/08/18 (月) 13:42:28 - おお まあ目的のものをWBでひっかけているだろうなとはおもいます。組織の方はネガこんをとっていますし、30kDaあたりには組織ではバンドがないのなら。 念のためもう一種類違う抗体で裏を取るというやり方はなきにしもあらずですが、なるべくエピトープが重ならないようなものとかでよく働くものとかいろいろ考えると抗体選びでかなりいろいろ見ないといけないかもしれないですし、それでバンドが出なかったからといって抗体を疑う余地がないわけでもありませんから。 あとは文献調査などして組織や細胞で検出しているようなものを当たっていけばすでにサイズが違うことが報告されているかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3302-6 - 2014/08/18 (月) 13:14:34 - 初心者 おお様 ご回答ありがとうございます。 不勉強で申し訳ありませんがcDNAというのは何を指しているのでしょうか？ WBの一次抗体に関しては同じものを使用しております。 追記ですが、マウス肝臓組織とヒト培養細胞でともに目的タンパク質の遺伝子発現をqRT-PCRでも測定しており、過剰発現で著増することは確認しています。

(無題) 削除/引用 No.3302-5 - 2014/08/18 (月) 01:00:59 - おお サイズが多少違っても何ら不思議ではありません。modificationの違いが一番疑われます。 肝臓のほうと、培養細胞の発現で全く同じcDNAをつかってますよね?

(無題) 削除/引用 No.3302-2 - 2014/08/17 (日) 17:12:36 - 初心者 お伝えし忘れましたが、培養細胞はヒトです。

培養細胞と組織でのウェスタンブロットのバンドの位置が異なる 削除/引用 No.3302-1 - 2014/08/17 (日) 17:11:22 - 初心者 　お世話になります。 　目的タンパク質を過剰発現させたマウスの肝組織を用いて過剰発現の確認も含めてその目的タンパク質の抗体を用いてウェスタンブロットを行いました。 　一次抗体はabcamで購入したもので、実際30kDaあたりにバンドが出るようにその抗体は示されており、培養細胞で過剰発現させた際にはその通りになったのですが、今回組織を用いた結果では40kDaあたりにバンドを認めました。 質問ですが、培養細胞と組織ではバンドの位置が異なるということはよくあることでしょうか。 　ちなみに、目的タンパク質のバンドでない可能性は否定しきれていませんが、過剰発現させていないものと過剰発現させたものを比べた時にバンドの明らかな濃度差を認めてはいました。 　よろしくお願いいたします。

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