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(無題) 削除/引用 No.3300-5 - 2014/08/18 (月) 08:40:29 - bb アニーリングの温度が違うと結果が異なると考える理由は何でしょうか？ 温度が高い場合と低い場合でどのような違いが起こるとお考えですか？

(無題) 削除/引用 No.3300-4 - 2014/08/17 (日) 13:48:20 - おお PCRのプライまーでまずいいと思いますが、プライまーのすぐ後の配列は読めないかもしれません、読むキャピラリーなどでその辺はどこから読めるか変わってくるかもしれませんが、数十ベースは余裕を持てといわれるので、プロダクトが100bpぐらいだとどうかなという気はします。両側から別々に反応させて読んでいって片方で読めないところを補うのが一般的だと思います。プライまーの下流どれぐらいのところから読めるかは経験者や委託するなら業者などにきいてみてください。よめないといっても波形がでててマトリックスが処理できなくって最初の方から目で追えば読めることもあるにはありますが。

ありがとうございます。 削除/引用 No.3300-3 - 2014/08/17 (日) 13:36:08 - 初心者 シークエンスは原理はわかるもののあまり行ったことがありません。 ゲルの切り出し・DNAの抽出まではしたことがあります。 実際抽出したDNAをシークエンスする場合，プライマーは何を使うのがいいのでしょうか？ 最初のPCRに使用したプライマーでしょうか？ それともランダムプライマーでしょうか？ ユニバーサルプライマーというのはいわゆるランダムプライマーといっしょですかね？ 予想PCR産物の配列では1か所特異的制限酵素サイトがあるので，切ってみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.3300-2 - 2014/08/17 (日) 13:19:37 - おお アニーリングの温度が違っていても程度温度が低いとPCRの効率は一緒かもしれませんね。またすでにsaturationを起こしているところで見ていればバンドの濃さは一緒かもしれません。 非特異が気になるなら、なるべく高い条件でやるのと、あとはバンドをシーケンスするか、制限酵素で予想されたように切れるか確認してください。4ベースカッターでも良く切れるものならかまわないです。

PCR 削除/引用 No.3300-1 - 2014/08/17 (日) 12:55:52 - 初心者 Tm値67.69℃のプライマーを用いてPCRを行いました。 3stepでアニーリング温度を55.60.65と少し大雑把に3点ふり，加えて2stepも含めてPCRをかけたところ， バンドサイズはほぼ目的のサイズと同等ですが，アニーリング温度間でバンド強度（見た目のみで定量はしていません）はほぼ同じでした。 アニーリング温度が大きく違っても，同じ反応になることはあるのでしょうか？ それとも単なる非特異バンドなのでしょうか？

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