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(無題) 削除/引用 No.3284-17 - 2014/08/09 (土) 01:57:49 - EcoRV/BglII 皆様たくさんコメント、アドバイスいただきまして誠にありがとうございます。 プライマーの制限酵素配列の5'側には2つのGを持たせてあります。これらが作用する制限酵素の足場として使われることを想定しています。 これまでのクローニングではTA cloningをはさんでいましたので、異なる2つの酵素で切り出す際には両末端が切断されていると確信を持てていたのですが、今のlabではTA クローニングを経済的に使えないため、direct cloningができればと思っています。 ［インサートがライゲーション可能な末端を持っているかどうかを確認したらということです。］ みなさまからコメントいただいた中でここをしっかり確認すべきだと思わされました。 私の今の方法では酵素がきちんとworkしているかもわからないですよね。一度insertだけでligaitonを行ってみて、ラダーが生じるか、あるいはmonomerだけなのかを確認してみることにします。 また、insert:vectorのratioも上げてみる事にします。 突出末端に比べ、平滑ではややligation効率がやや落ちるとのことで、ligationも16˚C, over nightでも行ってみる事にします。 ちなみに、PCRで増幅させたものをエタチンで濃縮して、そのサンプルを2つの酵素で1時間処理しています。（EcoRVとBgl II in Buffer 3+BSA）。 酵素処理の時間も長めにしてみようかとも思っています。酵素処理後、Qia Quick spin columnで精製して、それをEB bufferで溶出後、ligationに持って行っています。EB bufferにはEDTAは入っていないはずですので、ligationを阻害するということもないですよね。 まずは両末端が切れているか確認してみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3284-16 - 2014/08/08 (金) 20:21:11 - AP >blunt-endのPCR産物にわざわざ3' dA突出をつける処理をするのが意外と面倒。 最近、東洋紡がKODを使ったPCR産物に3' dA突出を付加するシステムとして、PCR反応後のKODの不活性化をanti-KOD抗体でやっておいてTaqを効かせるというのがあることを知った。これなら、手間もかからず確実だと思ったが、コスト面や、このキットはKODにしか使えないというところで、使用をためらう。

(無題) 削除/引用 No.3284-15 - 2014/08/08 (金) 20:14:20 - AP 一旦、TAクローニングをしてから制限酵素で切り出すという選択肢が有りなら、TAクローニングではなく、PCR産物の末端をリン酸化してblunt-endで脱リン酸化したベクターに一旦入れてしまうのも、意外と簡単で失敗が少ない。 TAクローニングは、T-vectorを購入するか自作するのにコストがかかるし、最近はproof-reading活性のある酵素でPCRするのが普通になってきているから、blunt-endのPCR産物にわざわざ3' dA突出をつける処理をするのが意外と面倒。

(無題) 削除/引用 No.3284-14 - 2014/08/08 (金) 18:38:34 - ~ EcoRV/BglII さんが経験者であることと、平滑末端は多少はライゲーションしにくいとはいえ全く入らないわけではないため、どのあたりを提案すればお役にたてるのか悩むのですが。 400bpのPCR産物が期待しているものであることを確認するために、ダイレクトシークエンシングするか、Tベクターに入れて読んでみてはいかがでしょうか。 特に一度Tベクターに入れて配列を確認してしまえば、ベクターの切り貼りの話になりますので、PCR産物に特有の話はなくなります。 また、もし、この問題が2週間以上解決しないのであれば、手持ちの適当なベクターコストラクトで、 ・Bgl II-数百bp〜1kb-Blant end の形が切り出せるものを探して切り出し、ライゲーションのポジティブコントロールにされてはいかがでしょうか。 PCR産物では処理中にどのようなことが起きているか分かりにくいですが、ベクターを切り出すだけであれば、PCR産物に特有の問題はなくなるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3284-13 - 2014/08/08 (金) 17:20:55 - ossi 私もsevenさんと同じことを考えました。 PCRで断片を増幅する際に、GCクランプなどの余分な配列は付加されていますか? 例えばEcoRVの場合、5'-GATATC[任意の配列]-3'といったプライマーで増幅しても、制限酵素で切りにくい可能性があります。 5'-gcgcGATATC[任意の配列]-3'といったプライマーで増幅すれば、gcgcの部分が制限酵素の足場になってより切れ易くなる、という話です。 BglIIの場合も同様です。

(無題) 削除/引用 No.3284-12 - 2014/08/08 (金) 16:56:55 - seven 一応確認しておきますが、PCRプライマーには制限酵素認識サイトの外側に付加配列をつけていますか？ 末端に制限酵素認識サイトがあると酵素によっては切れないor効率が低下します。 まずは切断確認が重要だと思います。 どうしても入らないようなら、PCR断片の方はTAクローニングなどで一旦プラスミドに入れてみても良いかもしれません。そうすればサイズ差による切断確認と必要な断片のみの抽出も可能です。

(無題) 削除/引用 No.3284-11 - 2014/08/08 (金) 16:30:03 - AP >UVを当てるとらいげーしょん効率が一気に下がるから。 UVでライゲーション効率が下がるというメカニズムがあるのだろうか？ 下がるのはライゲーション効率ではなくて、形質転換効率だと思うが（ピリミジンダイマー形成による）。

(無題) 削除/引用 No.3284-10 - 2014/08/08 (金) 15:15:31 - 台風一家 あと、らいげーしょんするインサートとベクターはUVに当てないほうがいいよ。バンドを確認するときにUVを当てるとらいげーしょん効率が一気に下がるから。すでに知ってたらごめんね。

(無題) 削除/引用 No.3284-9 - 2014/08/08 (金) 14:25:57 - AP monさんの >インサートだけで self-ligationしてみてください。 というくだり、質問者さんは理解していますか？ >私の感覚ではligationの効率はほんの僅かなのかなと思っていましたが、ligation後のサンプルの電気泳動でmultimerのバンドが見えるという事はかなり効率がいいのですね。 DNAや酵素がちゃんとしたものならば、ligation反応はめちゃめちゃ進みます。 ただ、末端がコンパチブルなら手当たりしだいにつないでしまうので、プラスミドにインサートを組み込むような場合、プラスミド一個にインサート一個が環状化したような望みの産物はごく一部であるということです。 言いたいことはそういうことじゃなくて、 インサートがライゲーション可能な末端を持っているかどうかを確認したらということです。 例えば、末端に設計した認識配列が制限酵素消化されていないというような場合（意外と多いです）、インサートだけでligationしてみれば、末端が消化されていない断片はモノマーのまま残ります。両端がちゃんと切れていれば、多量体を形成します。 その比率をみればどの程度、ligation-readyな断片ができているかわかります。ひどい時はほぼすべてがモノマーのまま残るということもあり、そういう時は同然、プラスミドとライゲーションしても組換え体は出てきません。

(無題) 削除/引用 No.3284-8 - 2014/08/08 (金) 13:56:13 - 台風一家 先週、同様な平滑末端と突出末端のらいげーしょんをしましたが、一発で目的のベクターを得ることができました。 その気になれば数百というコロニーを得ることができますよ。ちなみに自分は、インサート：ベクターのモル比を3:1に設定し、エレポでコンピテントセルに入れました。らいげーしょんきっとはトーヨーボーです。セルフライゲーションのコロニーは20個くらいでしたので、ほとんどが当たりでした。片側が平滑末端だからといって、とくにらいげーしょん効率が下がることは無かったです。

(無題) 削除/引用 No.3284-7 - 2014/08/08 (金) 13:33:47 - mon >ligation後のサンプルの電気泳動でmultimerのバンドが見えるという事はかなり効率がいいのですね。 いえ、普通です。 > EcoRVとBglIIという組み合わせは相性悪いでしょうか？切れにくい組み合わせですかね？ いえ。 また、EcoRVはSmaIよりligation効率も良いです。 > その後、NcoIで処理して、再度スピンカラムで精製してtransformという手順でいいのでしょうか？ 良いと思います。私の経験だと、２種類の制限酵素を用いる場合、制限酵素処理前にベクターをPlasmidSafe酵素(ATP-dependent DNase)処理した方が、 self-ligationを劇的に減らせるようです。 （ plasmid調製時に出来る極微量の制限酵素耐性の変性plasmidを消化する＝ほとんどの場合、制限酵素処理等は十分）。 > また平滑末端（ともう片方は突出末端）のライゲーションで気を付けるべき点ありましたらどうかご指摘ください。 突出末端に比べて ligation効率は落ちるので、DNAを多めに使う、くらいかな。

(無題) 削除/引用 No.3284-6 - 2014/08/08 (金) 13:11:15 - EcoRV/BglII monさん, Harmoniaさんありがとうございます。 ligationし終えたサンプルを泳動したことはありませんでした。 私の感覚ではligationの効率はほんの僅かなのかなと思っていましたが、ligation後のサンプルの電気泳動でmultimerのバンドが見えるという事はかなり効率がいいのですね。 びっくりしました。一度確認してみます。 EcoRVとBglIIという組み合わせは相性悪いでしょうか？切れにくい組み合わせですかね？ また、ベクターのMCSの並びはEcoRV-NcoI-BglIIですが、ligationし終えたサンプルをNcoIで処理して、それをtransformするとセルフライゲーションの割合が減ると過去のトピックでありましたが、その際の詳細な手順ご存知でしょうか？ ぜひ試してみたいです。 私の想像としては、まずPCR産物とベクターそれぞれをEcoRV, BglIIで処理後、スピンカラムで精製し、ligation後に、再度スピンカラムで精製し、その後、NcoIで処理して、再度スピンカラムで精製してtransformという手順でいいのでしょうか？ アドバイスいただけますと幸甚です。どうかよろしくお願い致します。 また平滑末端（ともう片方は突出末端）のライゲーションで気を付けるべき点ありましたらどうかご指摘ください。

(無題) 削除/引用 No.3284-5 - 2014/08/08 (金) 13:04:27 - EcoRV/BglII AAさん ありがとうございます。 コンピテントセルの数の限りもあって、それほど多く濃度をふれませんでした。 1:1以上でも行う必要ありますよね。。もう少しベクターの量を減らして相対的にインサートの比率を上げるようにしてみます。 これまで何度もligationしてきて、同じような方法をとってるのにも関わらず失敗が続いているので平滑末端特有のものなのかと思っていましたが、ligationの時間や温度でおすすめなのはありますか？ Rocheのキットでは室温, 5分でうたっています。 私は失敗がつづいていたので、室温、3-4時間を行ったのですが、それで今回の結果です。

(無題) 削除/引用 No.3284-4 - 2014/08/08 (金) 12:57:39 - Harmonia 不調のとき、僕は、ライゲーション反応液を電気泳動し、monさんが言われた ことをチェックしています。

(無題) 削除/引用 No.3284-3 - 2014/08/08 (金) 12:50:11 - mon インサートだけで self-ligationしてみてください。 両末端が制限酵素で切断されていれば、 3倍長以上の断片が電気泳動で見えるハズです（ラダーになる）。 両端が切断されていないとリン酸基がないので連結されず、そのままのサイズか、 片側だけで連結された２倍長の断片のみ見えます。

(無題) 削除/引用 No.3284-2 - 2014/08/08 (金) 12:27:57 - AA インサートのモル比をもっとあげてみてはいかがでしょうか？

平滑末端と突出末端の組み合わせでのライゲーション 削除/引用 No.3284-1 - 2014/08/08 (金) 12:00:40 - EcoRV/BglII 現在プラスミドの作製途中でのライゲーションを始めたばかりの者です。 PCRでインサートの末端にそれぞれEcoRVとBglIIサイトを付け、それをベクターにライゲーションしようと試みています。具体的にはEcoRVとBglIIを同時にbuffer3+BSA中で1時間, 37℃で反応後、精製して、それをライゲーションに供しています。 ベクターは4kbp, インサートは400bpです。 ライゲーションのモル比は1:1のみです。 インサートの代わりに水を入れてライゲーションすると20個ほど（セルフラーゲーションした）コロニーが取れましたが、インサートを入れてのライゲーションでは1/3ほどのコロニーが取れ、全てセルフライゲーションしたものでした。 ライゲーションはロシュのライゲーションキットを使い、室温, 3時間を行いました。 脱リン酸化処理はしていません。私はこれまでにそれなりに多くのコンストラクトを作製してきた経験はあるのですが、EcoRVを使った平滑末端のケースはありません。 脱リン酸化処理や、ライゲーション条件などご指摘いただけませんでしょうか？ どうか、よろしくお願い致します。

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