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(無題) 削除/引用 No.3284-37 - 2014/08/15 (金) 04:14:08 - おお > > 不思議なことに、酵素処理（EcoRVのみ、またはEcoRVとBglIIでのdigestion）でもそのバンドの高さが変わらないというのが気持ち悪いですね。。EcoRVとBglIIで切り出されるのは数塩基なので分子量的には変わらないのですが、リニアになるので随分とバンドの位置が変わるのが一般的だと思っていました。 > > いんたくとなプラスミドは通常スーパーコイルを形成していて酵素などできって直さ状のサイズより低めに出ます。バンドの形もなんかちょっともやっとしているとかふくらみがあるとかの場合がたいていで、直さ状のDNAと区別がつくことがおおいです。でも条件によっては見分けがつきにくいのかもしれません。とくにBgl IIとか塩濃度のたかいbufferを使うので、バンドが下にシフトする傾向があるとおもいます。 あ、精製してのぞいてからでしたら関係ないですね。。。

(無題) 削除/引用 No.3284-36 - 2014/08/15 (金) 04:10:40 - おお >[Re:35] EcoRV/BglIIさんは書きました : > おおさん > > はい。制限酵素で切ってからのligationです。ligase無しのサンプルを泳動してもvectorのbandは検出限界以下で、インサートの400bpのbandがシングルで期待通り見えます。insertだけでのligationはスメア状というよりは2400, 3000と高分子量領域にバンドが強めにでるのと、その周囲がスメアになっていました 2400, 3000が見えるならそんなに変ではないですが、周辺のスメアなバックグランドがたかいなら、なんか混じり物があるのかなという印象です。もちろん環状になったりというのも出てきたりするでしょうから、若干はスメアなばっくが出てもおかしくはないです。 > すみません。コンピテンシーをやや多めに書いてしまいましたが、pcDNA3.1 100 pgで400コロニーほどでしたので、0.3-0.4 x 10E7 cfu/ug (pcDNA3.1)くらいです。ラボにこれまで常備されていた自作の物とは随分コンピテンシーが低いです。（OD600 = 0.567でした。やや高めですよね。。？） ちょっとひくいですね。それでも何とかなりそうな気もしますが、10^7はほしいなあという感触です。OD600は確かにちょっと高めですが、つくりかたによってはさほど影響がない場合があります。 > > 不思議なことに、酵素処理（EcoRVのみ、またはEcoRVとBglIIでのdigestion）でもそのバンドの高さが変わらないというのが気持ち悪いですね。。EcoRVとBglIIで切り出されるのは数塩基なので分子量的には変わらないのですが、リニアになるので随分とバンドの位置が変わるのが一般的だと思っていました。 いんたくとなプラスミドは通常スーパーコイルを形成していて酵素などできって直さ状のサイズより低めに出ます。バンドの形もなんかちょっともやっとしているとかふくらみがあるとかの場合がたいていで、直さ状のDNAと区別がつくことがおおいです。でも条件によっては見分けがつきにくいのかもしれません。とくにBgl IIとか塩濃度のたかいbufferを使うので、バンドが下にシフトする傾向があるとおもいます。 プラスミドも調製し直した方がいいのかなぁ、、、ちょっと様子がわからないのでなんともいえませんが、TAやほかのものでもうまくいってないので、もんだいはプラスミドの質なのかちょっと断定しにくいですね。

(無題) 削除/引用 No.3284-35 - 2014/08/15 (金) 00:13:54 - EcoRV/BglII おおさん 改めましてコメントいただきありがとうございます。 PCRのアニール温度を高めにするような条件検討をただ今行っています。ありがとうございます。 > スメアになるというのはなんかおかしいと思いませんか?高分子側ではそうかもしれませんが低分子側では400, 800, 1200とラダーにならないといけないですよね。確認ですが、インサートを制限酵素できってからのligationですよね。ligationなしとの比較はしましたか? はい。制限酵素で切ってからのligationです。ligase無しのサンプルを泳動してもvectorのbandは検出限界以下で、インサートの400bpのbandがシングルで期待通り見えます。insertだけでのligationはスメア状というよりは2400, 3000と高分子量領域にバンドが強めにでるのと、その周囲がスメアになっていました。800, 1200のバンドは見えませんでした。オーバーナイト, 16℃でのライゲーションだからでしょうか。。ですがおっしゃるように変ですね。。 > PCRプロダクトをシーケンスすればプライまーの配列が間違えていたりというのはわかるかもしれませんが、、、 なるほど、TAに入れなくてもシークエンス読めるんですね。 一度sequenceしてみます。 > そちらの方が一般的ですが、電子レンジでつくっても、抗生物質をあとからぬってもworkするはずです。 そうなのですね。。となるとやはり自分の手技、PCR、形質転換が悪そうですね。。 すみません。コンピテンシーをやや多めに書いてしまいましたが、pcDNA3.1 100 pgで400コロニーほどでしたので、0.3-0.4 x 10E7 cfu/ug (pcDNA3.1)くらいです。ラボにこれまで常備されていた自作の物とは随分コンピテンシーが低いです。（OD600 = 0.567でした。やや高めですよね。。？） > 高い分子に出てくるのはnickがはいった環状のプラスミドの可能性が高いと思います。あるいはなにか大腸菌のエピソーマルなDNA(たぶんちがうとおもうけど)。 > ちゃんと取れていたらスーパーコイルのバンドがほとんどをしめてて、そのバンドが1本にみえることはよくあります。 不思議なことに、酵素処理（EcoRVのみ、またはEcoRVとBglIIでのdigestion）でもそのバンドの高さが変わらないというのが気持ち悪いですね。。EcoRVとBglIIで切り出されるのは数塩基なので分子量的には変わらないのですが、リニアになるので随分とバンドの位置が変わるのが一般的だと思っていました。 TAクローニングでさえ上手く行かないのをなんとかしたいです。 やはりコマーシャルなコンピテントセルで行うのが一番でしょうか。 ちなみにligationでものがとれなかったという判断はコロニーPCRです。この過去トピックを読むとコロニーPCRは信用出来ないと書かれてありましたので、大腸菌を増やしてその後miniprep/酵素処理をしましたが、切り出されてくるものはありませんでした。（27コロニーのうち、6コロニーをピックアップして確認しました）

(無題) 削除/引用 No.3284-34 - 2014/08/14 (木) 07:28:24 - おお >[Re:31] EcoRV/BglIIさんは書きました : > ligaseに関しては、前回ご指摘いただきましてinsertのみでligationを行ったところスメア状にbandがでましたので、活性はあるものと考えています。。 スメアになるというのはなんかおかしいと思いませんか?高分子側ではそうかもしれませんが低分子側では400, 800, 1200とラダーにならないといけないですよね。確認ですが、インサートを制限酵素できってからのligationですよね。ligationなしとの比較はしましたか? > 実はいくつか気になる点があります。（情報を小出しにして済みません。そういう意図はありません） > > 1. 時にprimerの配列通りのものが入荷されないと聞きます。IDTから購入しましたが、制限酵素配列がオーダー通りになっていない可能性はありませんでしょうか？再度オーダーし直すことはしなくてもよろしいでしょうか？ 全くないとはいえません。詳細は得られたデーターシートなど確認しながら会社に問い合わせてください。たまに作りにくい配列とかあって、ある程度のクオリティーまでは持っていってくれるけど、そう言う配列ではPAGEなどで精製しないとけっこう変なものが入っていることはあります。 PCRプロダクトをシーケンスすればプライまーの配列が間違えていたりというのはわかるかもしれませんが、、、 プライまーをオーダーし直すならわたしなら若干でもconstructionの方法をかえます。よくわからない理由でうまくいってない可能性を考えて > > > 質問はやはり、LBプレート、培地はオートクレーブして、十分冷ました後に抗生剤を加える方法が一般的でしょうか？ そちらの方が一般的ですが、電子レンジでつくっても、抗生物質をあとからぬってもworkするはずです。電子レンジは完全な滅菌でないですが、たいていのバクテリアは抗生物質で選択可能、真菌るいは増えるのが遅いので、O/Nでコロニーをpick upするのにはそんなに問題にならないです。しいて言えばファージとかがまじっているともしかしたら変なことが起こるかもしれません。ただ細かいテクニカルなことはあまり経験がないのでアドバイスできませんけど。 > > 制限酵素でBgl II単独、EcoRV単独、両方で切断するとメインの99%のバンドの位置や%は変わりなく、1%の超高分子量域のbandのみが酵素により消えます。プラスミドの立体構造はそれぞれのプラスミドでまちまちでしょうか？必ずしもいくつかのバンドが出る必要はないのでしょうか？ 高い分子に出てくるのはnickがはいった環状のプラスミドの可能性が高いと思います。あるいはなにか大腸菌のエピソーマルなDNA(たぶんちがうとおもうけど)。 ちゃんと取れていたらスーパーコイルのバンドがほとんどをしめてて、そのバンドが1本にみえることはよくあります。 >[Re:30] EcoRV/BglIIさんは書きました : > おお様 > > コンピテントセルはラボで自作されたものです。おそらく10E7 cpu/ugほどのコンピテンシーでそれほどは高くはありませんでした。ligation産物ではなく、既に完成されたプラスミドを形質転換する分に関しては全く問題にはなりませんが、ligation産物を拾おうとする場合、もっと多くのコンピテンシーは一般的に必要なのでしょうか？ 10E7 cpu/ugであればよっぽど難しいものでない限り大丈夫と思います。

(無題) 削除/引用 No.3284-33 - 2014/08/14 (木) 06:54:20 - おお >[Re:32] EcoRV/BglIIさんは書きました : > おおさん > PCR条件は、94℃, 3 min / 94℃, 30 sec - 55℃, 30 sec - 72℃, 30 sec （33サイクル）/ 72℃, 7 min / 12℃、無限大です。 > > アニーリング温度は確かに低いですが、一本の目的のサイズしかでませんでしたのでPCR条件は良いものと考えていました。質問で返してしまい大変恐縮ですが、そのような場合でもPCR条件を厳しくしてみることの意義というのはどういったことなのでしょうか？ たとえば何か微量でもあれば邪魔しそうなものがその一本のバンドのところに重なっていればどうしますか?まあそんなこともないのかもしれませんが、そう言う可能性がなるべくないようにというprecautionです。

(無題) 削除/引用 No.3284-32 - 2014/08/13 (水) 22:59:19 - EcoRV/BglII おおさん 何度もコメント、アドバイスいただき感謝しております。 >[Re:29] おおさんは書きました : > あとPCRの条件をバンドが出る範囲で厳しくしてみてください。アニーリング温度をあげるのがいいかと。 PCR条件は、94℃, 3 min / 94℃, 30 sec - 55℃, 30 sec - 72℃, 30 sec （33サイクル）/ 72℃, 7 min / 12℃、無限大です。 アニーリング温度は確かに低いですが、一本の目的のサイズしかでませんでしたのでPCR条件は良いものと考えていました。質問で返してしまい大変恐縮ですが、そのような場合でもPCR条件を厳しくしてみることの意義というのはどういったことなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3284-31 - 2014/08/13 (水) 22:56:16 - EcoRV/BglII > ligaseは失かつしてないでしょうか?あとはコンピテントの大腸菌の株を変えてみてください。コンピテンシーが高いことは当然ですが、あまり理屈じゃないところで相性みたいなのもあります(もちろん遺伝し型などで向き、不向きなものはありますが、それ以外にも見えないぶぶんで)。 ligaseに関しては、前回ご指摘いただきましてinsertのみでligationを行ったところスメア状にbandがでましたので、活性はあるものと考えています。。 私はこれまでTAクローニングを毎回はさんで遺伝子のクローニングを行ってきましたが、これまで作製した何十という機会においてもそもそもTAベクターにすら入らないというトラブルはありませんでした。 実はいくつか気になる点があります。（情報を小出しにして済みません。そういう意図はありません） 1. 時にprimerの配列通りのものが入荷されないと聞きます。IDTから購入しましたが、制限酵素配列がオーダー通りになっていない可能性はありませんでしょうか？再度オーダーし直すことはしなくてもよろしいでしょうか？ 2. TAクローニング時にAmpicillin入りのLBプレートにまくと思うのですが、現在のlab（それほど分子生物学が盛んではないです）では技官さんが抗生剤フリーのLBプレートを作製してくれています。どうも、オートクレーブではなく、電子レンジでLBの粉末カプセルとagarを加えたものを煮沸後、プレートに注いでいるようです。 抗生剤含有培地を作製してほしい、とお願いしたのですが、抗生剤ストック溶液をプレートに適量撒けばそれでいいよ、と言われてしまいました。実際それでzeocin（10 mg/mlストック溶液）を50 ulプレートの表面に塗って、その後形質転換後の大腸菌をまくと綺麗にセレクションかかりましたので、こんな便利な方法があるのだ、と信頼していたのですが。 TAクローニングの形質転換時には自作コンピテントセルDH5αを、抗生剤無しLBプレートに50 mg/ml Ampicillinストック溶液30 ulを塗って、その後撒いています。 質問はやはり、LBプレート、培地はオートクレーブして、十分冷ました後に抗生剤を加える方法が一般的でしょうか？ 3. ベクター側にも気になる点があります。私はEcoRVとBgl IIで切断していますが、切断する前にはメほぼ99%が一本のバンドで残り1%が超高分子量域にbandがでます。プラスミドの立体構造からもっとマルチプルなbandが出てもいいのでは。。と思ってしまいます。 制限酵素でBgl II単独、EcoRV単独、両方で切断するとメインの99%のバンドの位置や%は変わりなく、1%の超高分子量域のbandのみが酵素により消えます。プラスミドの立体構造はそれぞれのプラスミドでまちまちでしょうか？必ずしもいくつかのバンドが出る必要はないのでしょうか？ ただ、このベクターの問題は、TAクローニングが上手く行かないという問題とは全く別の独立した問題ですよね。。 すみません。どうか、引き続きお助けくださいますと幸甚です。どうぞよろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3284-30 - 2014/08/13 (水) 22:55:12 - EcoRV/BglII おお様 引き続きコメント、アドバイスをいただけること、心から感謝しております。ありがとうございます。 > 切れたベクターにも低いですがtransformation活性があります。でバックグランであっても1ugつかって20個は少ないような気がします。コンピテントは市販のものでしょうか。コンピテンシーがきになります。自作したものならコンピテンシーを確認していますか?買ったものなら何らかの原因で低下しているかもしれません。 コンピテントセルはラボで自作されたものです。おそらく10E7 cpu/ugほどのコンピテンシーでそれほどは高くはありませんでした。ligation産物ではなく、既に完成されたプラスミドを形質転換する分に関しては全く問題にはなりませんが、ligation産物を拾おうとする場合、もっと多くのコンピテンシーは一般的に必要なのでしょうか？ > > vector:insertの比率は圧倒的にinsertの方が多いです。 > > 1:数十ぐらいからtransformation活性が落ちてくると思います。ただしpositiveの割合が高くなりますので(90%ぐらいになってもおかしくない)、3個とれば十分ということはよくあります。 当初1:1 - 1:3ほどで行っていましたが、コロニーがはずればかりでしたので、現在、1:30くらいで行っていますが、昨日はコロニー27個（vector単独でのligationでコロニー20個でした。） > > ちなみにQia quickカラムから溶出する際には添付のEB bufferを用いています。 > > EDTAが入っていてもligationの反応などマグネシウムの濃度は10mMほど入ってますのであまりバッファーで問題になることはないとおもいます。それよりも、loadingやwashのバッファーのcarry overがあれば気になります。たいてい大丈夫だとはおもうんですが。 溶出に用いるEBバッファーですが、これにはEDTAは含まれていませんよね？その可能性があるのでは？と思って調べてみたらTrisの弱酸性緩衝液でした。また、溶出後には電気泳動にて目的の物が回収（高効率で）されていることは毎回確認しています。 > > 完全に行き詰まってしまいました。 > > やはりBglIIが切れていないのかと思い、TAクローニングキットを隣りのlabからお貸しいただき、PCR産物のTA cloningを行ってみたのですが、それについても青コロニーしか生えず、白い目的の物は生えてきませんでした。 > > > > 使用したTaqはQiagen DNA Taq polで、余分なA付加は起こるはずなのですが。。 > > > > > ちょっと様子がわからないのでなんともいえませんが、特にコロニー数がそれなりにある状況なら(なくても念のため)数個ぐらいはひろってみてください(あるいは系がしっかりしているのならコロニーPCRでもいいです)。ポジが青くなる理由がいくらかあります。 insert （400 bpほどの小ささです）50 ngほどをTA vector 0.5 ul + salt 0.5 ulで室温5minから3時間静置したものを自作のコンピテントセルに形質転換して、青白セレクションで約30個のコロニーが全て青でした。やや白っぽい（ですがやや青が帯びてる？コロニー15個ほどをつついてコロニーPCRをしましたが、全てはずれでした。）

(無題) 削除/引用 No.3284-29 - 2014/08/13 (水) 16:09:42 - おお あとPCRの条件をバンドが出る範囲で厳しくしてみてください。アニーリング温度をあげるのがいいかと。

(無題) 削除/引用 No.3284-28 - 2014/08/13 (水) 15:59:13 - おお >[Re:27] EcoRV/BglIIさんは書きました : > 制限酵素で切断後のvector (1 ugすべて) のみの形質転換で20個だけのの（セルフライゲーション）コロニーですので、基本的に酵素処理は上手く行っていると考えています。 切れたベクターにも低いですがtransformation活性があります。でバックグランであっても1ugつかって20個は少ないような気がします。コンピテントは市販のものでしょうか。コンピテンシーがきになります。自作したものならコンピテンシーを確認していますか?買ったものなら何らかの原因で低下しているかもしれません。 > > vector:insertの比率は圧倒的にinsertの方が多いです。 1:数十ぐらいからtransformation活性が落ちてくると思います。ただしpositiveの割合が高くなりますので(90%ぐらいになってもおかしくない)、3個とれば十分ということはよくあります。 > > ちなみにQia quickカラムから溶出する際には添付のEB bufferを用いています。 EDTAが入っていてもligationの反応などマグネシウムの濃度は10mMほど入ってますのであまりバッファーで問題になることはないとおもいます。それよりも、loadingやwashのバッファーのcarry overがあれば気になります。たいてい大丈夫だとはおもうんですが。 > > 完全に行き詰まってしまいました。 > やはりBglIIが切れていないのかと思い、TAクローニングキットを隣りのlabからお貸しいただき、PCR産物のTA cloningを行ってみたのですが、それについても青コロニーしか生えず、白い目的の物は生えてきませんでした。 > > 使用したTaqはQiagen DNA Taq polで、余分なA付加は起こるはずなのですが。。 > > ちょっと様子がわからないのでなんともいえませんが、特にコロニー数がそれなりにある状況なら(なくても念のため)数個ぐらいはひろってみてください(あるいは系がしっかりしているのならコロニーPCRでもいいです)。ポジが青くなる理由がいくらかあります。 いずれの系も方法論的に問題がなさそうなので、どこかワークしていない部分があるようなきがします。 ligaseは失かつしてないでしょうか?あとはコンピテントの大腸菌の株を変えてみてください。コンピテンシーが高いことは当然ですが、あまり理屈じゃないところで相性みたいなのもあります(もちろん遺伝し型などで向き、不向きなものはありますが、それ以外にも見えないぶぶんで)。

(無題) 削除/引用 No.3284-27 - 2014/08/13 (水) 15:23:34 - EcoRV/BglII APさん、おおさん >まあ、10%でも切れているのがあれば、取れ高がゼロということは無いと思いますが。 >印象的にそんなに難しいstrategyではないので、なんがしかの理由でライゲーションがうまくいってないような気がします。 私はvector (約5kb, 1 ugを使用) をEcoRV / BglIIで2時間, 37℃で処理して、Qia quickカラムで精製後、電気泳動を行い、bandの濃さから凡そのvectorの量や濃度を算出しています。 そのうち30 -50 ngの酵素処理済みvectorをligationに使用しています。insertを入れない状態でもDH5αにEcoRV/BglII処理済みvector単独で形質転換すると20個ほどコロニーが出来てしまいます。 制限酵素で切断後のvector (1 ugすべて) のみの形質転換で20個だけのの（セルフライゲーション）コロニーですので、基本的に酵素処理は上手く行っていると考えています。 一方、インサートに関しては、PCRで目的のbandのみが電気泳動で確認されますし、末端の足場は確かに2つと少ないですが、PCR産物をゲル抽出して、BglIIとEcoRVで制限酵素処理した後、Qia quickカラムで精製してligationしています。 vector:insertの比率は圧倒的にinsertの方が多いです。 ちなみにQia quickカラムから溶出する際には添付のEB bufferを用いています。 しかし、目的のligation産物が一つも取れません。すみません今日も酵素処理したvectorのみの形質転換で18個、insertとvectorでligationしたもので形質転換したもので27個コロニーが確認され、27個全てがはずれでした。 完全に行き詰まってしまいました。 やはりBglIIが切れていないのかと思い、TAクローニングキットを隣りのlabからお貸しいただき、PCR産物のTA cloningを行ってみたのですが、それについても青コロニーしか生えず、白い目的の物は生えてきませんでした。 使用したTaqはQiagen DNA Taq polで、余分なA付加は起こるはずなのですが。。

(無題) 削除/引用 No.3284-26 - 2014/08/13 (水) 14:57:28 - EcoRV/BglII >ぺーぺーさん 返信が遅れました事、申し訳ありません。 また英語版のbiotechnical forumをご紹介いただきありがとうございます。 エタチンでは酵素が除けないこと、よく理解できました。ありがとうございます。 >APさま 私はQiagenのTaq DNA polymeraseを使用しています。 http://www.qiagen.com/products/catalog/assay-technologies/end-point-pcr-and-rt-pcr-reagents/taq-dna-polymerase#productdetails この酵素は3'->5' exonuclease活性は無いと書かれてあります。ですが、中には3'の突出を無くしてしまう酵素もあるのですね。今回の私の例に関しては問題とはならないと思いますが今後気をつけようと思います。ありがとうございます。 ossiさま とても衝撃的なサイトを教えてくださりありがとうございます。 そうなんですね。。この表に載ってしまうほどBgl IIは足場の必要性がクリティカルなのですね。 プライマーを注文する際今後は基本、3塩基を付けるようにし、この表も今後参考にしていくことにします。ありがとうございます。また新しくプライマーを注文します。

(無題) 削除/引用 No.3284-25 - 2014/08/10 (日) 05:48:44 - おお >[Re:18] EcoRV/BglIIさんは書きました : > すみません、一点確認ですが、今回制限酵素処理後に前のlabではゲルから抽出していたのですが、回収効率がかなり悪く、そのためQia Quick spin columnで精製しています。 > > この時、制限酵素によって両末端の短いDNA断片は回収されないですよね？ PCR後、制限酵素処理してからQia Quick spin columnを通すか、PCR後Qia Quick spin columnで精製して、さらに制限酵素処理後もう一度Qia Quick spin columnで精製すれば、制限酵素の活性を気にせずにligationできるのでは。 印象的にそんなに難しいstrategyではないので、なんがしかの理由でライゲーションがうまくいってないような気がします。 たいていのそう言うスピンからむはプライまーとかは抜けるようなレンジで設定されているようです。ただえいどうで見えなくても短いものがあって(50-400bpのあいだとかに)それが邪魔するというシナリオはなきにしもあらずです。そう言うときはバックグランドがあがって、入ってないクローンがたくさん取れる傾向があると思いますが、その逆はないともいえません。 まあゲルから切り出しすればこの辺の不安は解消されるでしょうけど。10ngあれば一回のligationに十分だと思うので、、、 あと分子数比は変えても劇的な変化はありませんので、それを原因とは言い難いです。

(無題) 削除/引用 No.3284-24 - 2014/08/09 (土) 14:34:54 - AP >特に、BglIIは2塩基だと完全には切断できないようです。 NEBとFermentasの資料だと切断効率50-100%で、彼らのカテゴリーでは一応、最高ランクです。まあ、10%でも切れているのがあれば、取れ高がゼロということは無いと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.3284-23 - 2014/08/09 (土) 10:59:18 - ossi > プライマーの制限酵素配列の5'側には2つのGを持たせてあります。これらが作用する > 制限酵素の足場として使われることを想定しています。 http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100006082 に記述が有りますが、足場の配列は3塩基以上にするのが無難なようです。 特に、BglIIは2塩基だと完全には切断できないようです。 ご参考までに。

(無題) 削除/引用 No.3284-22 - 2014/08/09 (土) 10:49:45 - AP 少なくともラボで使用する耐熱性DNA polのなかに、EtOH pptで完全失活するものはなかったはずです。 耐熱性DNA pol活性の残留が大きく影響するのはproof reading活性のある酵素で、dNTPが十分に無い条件では、exonuclease活性で3'末端から内側に向かって削りこみが起こり、ligationできない状態になる可能性があります。 proof reading活性のないTaqであれば、活性が残留しても問題は少なそうですが、EtOH pptだけではdNTPは除けないので、polymerase活性が働き、ベクターやインサートの5'突出末端を平滑化してしまう可能性があります。

(無題) 削除/引用 No.3284-21 - 2014/08/09 (土) 10:13:33 - ぺーぺー 以前、STRATAGENEのhigh fidelity 酵素をエタ沈で処理後、taqで処理してTAクローニングしたことがあります。しかし、今から考えると間違った方法だったと思います。 最後まで読んでいませんが、下のサイトはトピ主様のお役に立つのではないかと思いました。 http://www.bio.net/bionet/mm/methods/2000-July/084097.html

(無題) 削除/引用 No.3284-20 - 2014/08/09 (土) 07:23:49 - EcoRV/BglII dasさん コメントありがとうございます。 それが、していないんです。 Taq polymeraseはエタノール沈殿では失活しないでしょうか？ 制限酵素処理の際にTaqの活性が残っているとなると、やはりフェノクロ沈はするべきなんでしょうか。。

(無題) 削除/引用 No.3284-19 - 2014/08/09 (土) 05:47:29 - das 1点確認ですが，エタチン前にフェノクロ処理をしていますよね？ >ちなみに、PCRで増幅させたものをエタチンで濃縮して、そのサンプルを2つの>酵素で1時間処理しています。

(無題) 削除/引用 No.3284-18 - 2014/08/09 (土) 02:07:12 - EcoRV/BglII すみません、一点確認ですが、今回制限酵素処理後に前のlabではゲルから抽出していたのですが、回収効率がかなり悪く、そのためQia Quick spin columnで精製しています。 この時、制限酵素によって両末端の短いDNA断片は回収されないですよね？

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