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(無題) 削除/引用 No.3283-6 - 2014/08/08 (金) 13:21:20 - EcoRV/BglII 蛍光標識の程度が6289さんの目的の抗体とアイソタイプの抗体で異なるのかもしれませんね。 基本的には同じ濃度で行いたいですが、蛍光標識の効率が必ずしも同じわけではありませんし、中々難しいですね。 ポリスチレンビーズがもしお手元にありましたら、そのビーズに目的の抗体、そしてアイソタイプをそれぞれ吸着させ、そのビーズの蛍光強度を比べる一方で、別色の蛍光標識二次抗体で一次抗体付きビーズを染めて、凡その蛍光標識の度合いを見積もるというのも手ですね。 もし仮に標識効率が同程度であれば、同一濃度を用いればいいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3283-5 - 2014/08/08 (金) 11:34:34 - flowjoe No.3283-2指摘されておりますが、FCMに限らず、アイソタイプコントロールでノンスペが出やすい場所を確認したり、ノンスペが出ちゃうからFCブロッカー試したりするためのコントロールとしても使うのでアイソタイプコントロールは濃いめで試してみるべきではあります。それでもシグナルがなければ目的の抗体の特異性を示す事になりますから。 なので、カスタマーセンターはトップダウンで、アイソタイプコントロールは濃いめで使え！この答えが気に入らないなら自分で考えて自分で検討しろ！とやんわり言ったのかもしれませんね。 また、濃度表示も抗体が異なれば測定法や糖鎖やらの関係でずれているので注意が必要です。 まあ、濃度合わせてやれば合理的なので、異常がない限りダメだとは言われないでしょう。 でもポリクロでこれをやってる人いますけど、ポリクロってアフィニティー精製されていても、いくら希釈してもノンスペ出るものありますよね。メソッドの細かいところ突っ込むレビューアー見た事無い。というか、私の作った抗体で変なことしてるから突っ込んだらエディター共々無視しやがった。

(無題) 削除/引用 No.3283-4 - 2014/08/08 (金) 09:52:01 - 6289 ほし様、~様、ご丁寧な返信ありがとうございます。 大変基本的なところですが、アイソタイプコントロールの認識は間違っていなかったのだと思ってほっとしています。 確かに、何かの根拠があって違う濃度でやってくださいと言っているのか、 ただカスタマーセンターの方が理解していないのかのどちらかだと思います。 しかし、濃度を聞かないと教えてもらえず、しかも誤差の範囲を超える濃度の違いがあるという点を考えると、なにかの根拠があるのかもしれません。 ほし様のいうとおり、まずは両方のやり方で試してみたいと思います。 ご返答りがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3283-3 - 2014/08/08 (金) 09:11:27 - ほし 濃度を揃えるのが正攻法だと思いますが、カスタマーセンターの行っている方法と両方とも試したらどうですか？カスタマーセンターの人は、１０倍希釈で使う抗体として販売しているのだから、そう使ってください、と言っているように聞こえます（私も正しくない気がしますが）。 結果的には、タイターの高い抗体ならアイソタイプコントロールと３倍程度濃度違っても同じ結果になると思います。

(無題) 削除/引用 No.3283-2 - 2014/08/08 (金) 09:11:17 - ~ 目的とする抗体とアイソタイプコントロールを同じ濃度で処理したものしか見たことがありません。 全製品でそうなのかは確認してませんが、シグマもアフィメトリクスも目的の抗体と同じ濃度で使うように書いてあるアイソタイプの製品がありますね。 アイソタイプで偽陽性がでないことが前提ですが、3倍の濃度でもアイソタイプで陽性シグナルがないことを根拠に、目的とする抗体のシグナルが特異的であるとみなすキットなのかもしれません。 ただ、アイソタイプで偽陽性が出てしまうと、目的の抗体での偽陽性を3倍大きく評価する必要が出てくるかもしれませんが。 カスタマーセンターが測定原理を説明できていないようですので、 技術担当と話をさせてもらってはいかがでしょうか。 何か妥当性のある根拠を元に、異なる濃度での処理を推奨しているのかもしれません。

FACSの時のIsotypeControlについて 削除/引用 No.3283-1 - 2014/08/07 (木) 18:45:16 - 6289 大変基本的な質問で申し訳ございませんが質問させてください。 現在、FACSにて細胞内の蛋白の発現について解析しています。 皆様当然アイソタイプコントロール抗体をつけた細胞を流していると思います。 先日ある会社のある細胞内蛋白に対する抗体と、アイソタイプコントロールをセットで買いました（両者とも蛍光標識済みのものです）。しかし、抗体の濃度（？μg/ml）が記載されていなかったため、カスタマーセンターに連絡したところ、目的とする抗体の濃度と、アイソタイプコントロールの濃度が3倍近く違うことがわかりました。 ここまではいいのですが、カスタマーセンターの方は、プロトコール通り、両者とも1.0×10＾6細胞を含む100μLの細胞懸濁液あたり10μLの抗体を入れてくださいと言われました。これでは、両者の濃度がそろっていないこととなり、濃度の調整はしなくていいのか食い下がったのですが、そういう製品なので…との一点張りでした。 これはカスタマーセンターの方がアイソタイプコントロールの事をよく理解されていないのか、私が何か基本的なことを誤解しいるのか、それとも製品によっては、そのようになることもあるのか、分からなくなってしまいました。 いつも、目的とする抗体と、アイソタイプコントロールの両者の濃度を見て、必ず濃度は揃えて実験していて、それが正しいと思っていたので混乱してしまっています。 大変基本的なことで申し訳ございませんが、皆様のお考えを聞かせていただければ幸いです。

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