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(無題) 削除/引用 No.3280-10 - 2014/10/19 (日) 17:09:42 - ねこむら おお様＞ NativePAGEで、逆方向に泳動されているかどうかの確認もしましたが、見られませんでした。 また、新しいCBBを購入（Serva社）し、BN-PAGEを行ってみましたが、やはりBSAのコントロール以外はスメアでバンドが確認できませんでした。 ただ、BSAとtRNAを過剰に共存させた場合、標的RNAとのGel shift Assayでは予想された挙動を示しました。普段から疎水結合でアグリゲーション気味なのだろうと思います。BN-PAGEではっきりしたバンドを確認するためにはRNAと複合体を作るなどの検討が必要なのかもしれませんが、原著によると核酸の混入はあまりいいことではないようなので、界面活性剤の検討なども含めて今後時間ができたら行おうと思います。 みなさま、さまざまなアドバイスを頂きありがとうごさいました。

(無題) 削除/引用 No.3280-8 - 2014/08/20 (水) 12:49:25 - おお ﾊﾞﾝﾄﾞがどこにも見付からないならはんたいがわに流れているかもしれませんね。それならそれを逆手にとって、中性、または酸性のゲルで電極を逆にして流すてがあるかもしれません。そうしたばあいCBBとかは使えませんね。。。ポジティブにチャージしたしきそならつかえますけど。 電極を逆にするシステムはヒストンやHMGなどでやられることがあるようです(私も調べないと細かい条件はしらないのでかけませんけど)。ただ分子量的ににはかなり違うので、、、

(無題) 削除/引用 No.3280-7 - 2014/08/20 (水) 11:55:14 - ねこむら コメントありがとうございます。参考にして、少し実験をしてみました。 aji 様> 　WakoのCBBで成功した人はいないんですね。ラボに余裕があれば色々なCBBを試すということも出来るんですが、他の要因が排除できなければ厳しいかもしれません。高純度のものは、Serva社などのものということでしょうか。 　相変わらずWakoのCBBで試しており、Nature Protocolsの条件ではうまくいかないものの、後述するTris/Glycine NativePAGE（0.002% CBB G250)では多少うまくいくようになりました。 おお 様> Tris/ Glycine Native PAGEに、Cathodeだけ0.02 % のCBBを入れて泳動したら、BSAに関しては濃い一量体と、薄い二量体のバンドが検出されました。 ＜現在の条件＞ 　Atsuhiko Ishidaら(Analytical Biochemistry, 2013)の論文で、10 mM Tris/ 77 mM Glycine, 0.002% CBB-G250 (Wako)、均一ゲル 15 %でワークさせているのを発見しました。その条件では、コントロールとしているBSAはうまく泳動されるようになりました。この論文は万年筆用のinkをCBBの代わりに使うという面白い論文です。 　しかし、目的のタンパクのレーンだけはバンドが検出されません。やはり、コントロールのBSAがうまく泳動されたとはいえ、目的のタンパクに合う条件を探す必要があるのでしょうか。pIが11付近であることもうまくいかない原因かもしれないと考えています。

(無題) 削除/引用 No.3280-6 - 2014/08/10 (日) 08:32:41 - おお たとえばプロテアーゼインヒビターとして蛋白を抽出するときに使うアプロチニンは6.5kDaで低分子用マーカーとしても利用されることがあります。またRNase Aは14kDaぐらいじゃなかったでしょうか。 これぐらいのものならラボに転がってて、マーカーに転用できるかもしれませんけど。まあ目的が違うので無駄にせい精度が高かったりして、そう言う意味では贅沢な実験かもしれませんけどね。 Tris/GlycineのPAGEでもCBBをいれるともしかしたらよくなるかもしれません。CBBを入れるのは変成作用がないSDSと同じ効果があるものとしてBN-PAGEではつかわれてますから。CBBのかわりにdeoxycholateをつかう方法も彼らは考案してますね。ネガティブチャージをもった非常にマイルドなdetergentです。これもTris/GlycineのPAGEで応用してもいいかも。

(無題) 削除/引用 No.3280-5 - 2014/08/09 (土) 15:46:00 - aji CBBについてですが、高純度のものであれば大丈夫です。しかし、和光のは確か50%ぐらいだったと思います。他の要因は排除出来ませんが、私の周辺で和光のCBBでBlue-Nativeが成功した人はまだいません。 均一ゲルだと分子量の範囲として見える幅はかなり狭まりますので、スメアになるというよりは、そもそも分離能がSDS-PAGEには遠く及はないことが目に見えるだけです。 例えばグラジエントゲルで100kDaのバンドがそれなりに細く見えても、実際には90-150kDaの幅ぐらいにに広がっている状態が論文のバンドだと考えたら分かり易いと思います。これを均一ゲルで見ると、バンド幅はやはりその分子量の範囲に広がるので、スメアになったように見えます。 他にはゲルを固体のアクリルアミドとビスから作った場合は問題なかったけどBioRadのABmixで作った時は綺麗に流れなかった経験はあります。 サンプルによってはNature protocolのイミダゾールを使ったバッファーよりもより古い論文のビストリスを使ったバッファーの方が分離が良かった場合もあります。

(無題) 削除/引用 No.3280-4 - 2014/08/09 (土) 13:39:27 - ねこむら >おお様 コメントありがとうございます。 見たいタンパクがモノマーで10kDなので、15%くらいでないと分離できないのかなと考えて、この濃度にしています。やはり元の論文や他の文献でも均一ゲルはスメアになることもあって、推奨されないようです。 CBBはServaだけがいいというわけではないということですね。 URL貼って頂いたNativePAGEはいつも回しているTris/GlycineのPAGEなので、試してみたいと思います。ただ、アルギニンリッチなタンパクで、SDS-PAGEでも5~10kDくらい上にバンドが上がるタンパクなので、うまくいくか不安です。

(無題) 削除/引用 No.3280-3 - 2014/08/06 (水) 14:21:57 - おお RNAにかんしては、蛋白に結合している部分は結合によりprotectiveになっているという話もあります。ただ個々の事例でどうかわかりません。ただその前にえいどうのシステムをまずworkさせるのが先かと思います。

(無題) 削除/引用 No.3280-2 - 2014/08/06 (水) 14:18:34 - おお ゲルの濃度15%は高すぎると思います(60kDa以下がみたいなら別ですが)。マーカーはSDSPAGE用は流れたとしても当てになるかどうか分かりません。BSAはまるチマーが検出されることがあるようなので、66と132kDaぐらいはわかるかもしれません。 CBBはServa製は使ってないです。EMDのhigh pureをいまは使ってますが、Serva製もよく調べるとそんなにpureではないです。EMDのhigh pureのまえはsigmaの古いやつをつかってましたが、その時はあまりうまくいかなかったのですが、色々試行錯誤したため、CBBが悪かったのかどうかよくわかりません。 Schaggerら（Nature Protcols, 2006)の論文には、均一ゲルが使われることはまれで解像度になんが出る可能性はあるみたいです。 均一のゲルならSDSPAGEのSDSを抜いたシステムの方がもしかしたらベターかもしれません。 http://www.assay-protocol.com/molecular-biology/electrophoresis/native-page

BN-PAGEに使用する試薬の純度について 削除/引用 No.3280-1 - 2014/08/06 (水) 10:38:26 - ねこむら 　現在、BN-PAGEを利用して、あるタンパク質（10kD）の多量化の検出を試みています。 そのタンパク質は複数のLeu残基で疎水的な結合をして、単量体、二量体、六量体構造をとり、それぞれの疎水的結合に関わるLeu残基を置換することでその多量化も制御し得ることが示唆されています。また、アルギニンリッチなRNA結合領域も有しており、結合相手のRNAがいないとアグリゲーションを起こしている可能性もあると考えられます。 　このようなタンパク質をSchaggerら（Nature Protcols, 2006)の論文に従って、実験を行っています。新しい実験への投資はなるべく抑えたいということで、ほとんどの試薬は論文に記載のメーカーと異なってしまっています。基本的にはBufferの濃度、泳動条件なども同じですが、今のところ濃度均一ゲル15% or 20%でやっています。サンプルは他の可溶化Bufferに溶かしているため、DigitoninやTritonXなどで可溶化もしていません。 　しかし、自分のサンプルだけでなく、マーカー（SDS-PAGEで使っているPre-stainのもの）、BSA（コントロール）などもうまく流れません。Separategelに入って0.5~1cmのところで止まってしまう感じです。止まってしまっている部分と泳動先端の間にすべてのLaneでスメアな帯が見られますが、これがサンプル由来のものかは判断できません。 NativeのPAGEを行うのが初めてなのでいろいろと分からないのですが、マーカーはNative用でないといけないのでしょうか。それから、G250は以前のトピックでServa製でないとうまくいかないとありましたが、Wakoのものでは本当にうまくいかないのでしょうか。あるいは、可溶化していないのが、問題なのでしょうか。 長くなって申し訳ありませんが、よろしくお願いします。

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