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(無題) 削除/引用 No.3278-3 - 2014/08/06 (水) 08:50:23 - OK しっしさん 分かりやすいサイトまで教えていただきありがとうございました。 NEBでBglIIを購入したのですが、それによると熱失活は出来ないと書かれてありました。 つい先ほどQIAquick PCR Purification Kitにて制限酵素処理後のサンプルを精製したところ、ゲルから抽出した場合に比べ格段の回収率の上昇を認めました。 これで制限酵素を除く（buffer交換という意味としても）ことができるんですね。 今後はこれで行こうと思います。 ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3278-2 - 2014/08/06 (水) 08:05:54 - しっし http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.php?unitid=U100002666 タカラの制限酵素各種失活処理後の残存活性一覧です。 この表によるとタカラのBglIIは70℃、15分間の処理で失活する事になっていますね。 それかフェノール処理。 >つまり制限酵素処理のサンプルをエタチンしただけでは制限酵素は除かれないということでしょうか？ 制限酵素によってはエタ沈だけでは失活しません。あまり気になったことはありませんが。 >あるいはQIAquick PCR Purification Kitが使えるのなら、これで制限酵素を除くことができると考えていいのでしょうか？ はい。問題ありません。

QIAquick PCR Purification Kitかエタ沈か 削除/引用 No.3278-1 - 2014/08/06 (水) 07:18:06 - OK いつも勉強させていただいています。 当方分子生物学は初心者で、解説本などみながら見よう見まねでクローニングを行っています。 ゲルからのPCRバンドの抽出はかなり効率が悪く、そのためエタチンにて十分量のPCR産物（シングルバンド）を回収できました。 これを２つの制限酵素で処理して、その後ligationしていきたいと思っていますが、ここで分からないことがありますのでみなさまご教示ください。 ligationするために制限酵素を除かなくてはなりませんが、BglIIという酵素は熱失活できないようです。そこで、QIAquick PCR Purification Kitで制限酵素を除くか、あるいはPCR産物を濃縮精製したようにエタチンを行うかで悩んでいます。 エタチンのプロトコルは3M AcONa (pH5.2)を1/10量加え、100 % EtOHを2.5倍量加え、-20℃で30 min置いた後、遠心しています。 調べると、制限酵素をフェノクロしてエタチンするなどが書かれてありましたが、これはつまり制限酵素処理のサンプルをエタチンしただけでは制限酵素は除かれないということでしょうか？ あるいはQIAquick PCR Purification Kitが使えるのなら、これで制限酵素を除くことができると考えていいのでしょうか？この添付文書には、［QIAquick スピ ンカラムを用いてマイクロ遠心機により、プライマー、ヌクレオチド、ポリメラー ゼ、塩などが100 bp~10 kbのフラグメントから取り除かれます。］と書かれてあります。 このことから制限酵素処理のサンプルをこれを用いてDNA断片の精製が行え、尚かつ制限酵素で切れた端の短い断片も除かれると考えてよろしいでしょうか？ 大変わかりずらく読みにくい文章かと思いますが、どうかみなさまご教示ください。

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