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(無題) 削除/引用 No.3276-9 - 2014/08/11 (月) 18:22:16 - けむ >[Re:8] ~さんは書きました : > 報告されている配列が2種類あるのですから、SNPsとして両方調べてはいかがでしょうか。 たしかにこれはvariantというよりもSNPsと言った方が適切かもしれませんね。 >[Re:6] おおさんは書きました : > 昔にすでにキャラクタライズされている遺伝子であればHeLaからとってすでにそれを使って実験をしているデーターもあるかもしれません。そういうのはgene bankに登録されている可能性があるでしょうし、そうすればどういう実験で使われていたかなどわかると思います。 > どうやら同じ変異のものがgenbankに登録されており、元の情報は２０年以上前の論文でヒト繊維芽細胞からクローニングされて全長配列が論文に載っておりました。よって私がもっている遺伝子はRefseqとは少し違うがすでに論文になっているようなので（正常な遺伝子として）、そのまま使えってもよいかなと思えてきました。

(無題) 削除/引用 No.3276-8 - 2014/08/11 (月) 11:05:31 - ~ Artifactと判断するには同じ配列の報告が多いようですね。 >variantの一つだと考えてそのまま使用 Variantと判断するのであれば、"あるvariantを持つ遺伝子の機能解析"が目的であれば、片方のvariantのみの解析をしようとは思いません。 報告されている配列が2種類あるのですから、SNPsとして両方調べてはいかがでしょうか。 違いが見られた時には1~数ランク上の雑誌に投稿できるか、別にもう1報書けるかもしれません。 病気や薬理に絡められれば、さらに発展させられるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3276-7 - 2014/08/10 (日) 12:56:02 - おお > ただ、得られたものがクローにんぐの過程でのartifactかどうかは慎重になった方がいいかと思います。一応ゲノムをシーケンスすればいいでしょうか。。。もちろん得られた数クローンで同じであればPCRのエラーは考えにくいですけど。 あと2種類ある時はalleleの違いを見ている可能性もあります。

(無題) 削除/引用 No.3276-6 - 2014/08/10 (日) 06:24:38 - おお 昔にすでにキャラクタライズされている遺伝子であればHeLaからとってすでにそれを使って実験をしているデーターもあるかもしれません。そういうのはgene bankに登録されている可能性があるでしょうし、そうすればどういう実験で使われていたかなどわかると思います。 Refseqをスタンダードにというふうにはなってきていますので、それでやる方が無難だと思いますけど、それは実験、本人の考え方次第だとおもいます。その細胞のendogenousな蛋白が生理的に機能していることがわかっているならば、その配列の違いを気にする必要もないかと。むしろそっちの方がいいという見方もありますから。 欲を言うとrefseqとあなたがとったクローンで全長だけでも比較しておけば、両者に差がなかったとしても、論文に一行入れるだけでしょうけど、発表の価値があるとおもいます(個人的にはきっちり研究していると評価されるべきとおもう)。 ただ、得られたものがクローにんぐの過程でのartifactかどうかは慎重になった方がいいかと思います。一応ゲノムをシーケンスすればいいでしょうか。。。もちろん得られた数クローンで同じであればPCRのエラーは考えにくいですけど。

(無題) 削除/引用 No.3276-5 - 2014/08/09 (土) 13:57:17 - ほし 独立に２回RT-PCRして同じ置換が入っているなら、そちらが本来の配列ではないのですか？ ２クローンの由来によるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3276-4 - 2014/08/05 (火) 22:00:45 - けむ ありがとうございます。 ２クローンのシークエンスをした限りでは同じポイントミューテーションをもっており、同じポイントミューテーションをもつESTは、人の正常組織由来のものも複数あります。 この場合、野生型と考えて使用しても良さそうですが、これからトランケーションなどいくつかのコンストを作らないといけないので、後で全部作り直すよりかは、やはりRefseqに合わせたほうが、やはり安心感はありますね。

(無題) 削除/引用 No.3276-3 - 2014/08/05 (火) 20:23:52 - くろ 自分の場合、普通、そういう場合、どのクローンでも同じなのか、複数のESTがあるかを判断基準にしています。もちろん、絶対そうとはいえないわけですが、確率的にそうなることはかなり低いので。RefSeqと同じのもあったほうが良いわけではあるので、余裕があるなら作りますが。

(無題) 削除/引用 No.3276-2 - 2014/08/05 (火) 18:49:05 - ろん そのアミノ酸が機能に重要であるならRefseqの配列に戻した方がいいと思いますが、それほど影響がないならそのままでもよいかと。 そもそも、拾ってきたクローンは1つしかないのか、複数あって全部同じ変異があるのかで状況は違ってきて、全部変異があるならHelaはそのバリアントを発現していることになるし、1つのクローンしか配列を読んでないなら、もっとクローンを拾って確認する必要があるのでは（Refseqの配列もあるかも）？ クローンを拾うのがとても大変な分子（長いとか）でようやくひとつとれてきたなら、1アミノ酸分の塩基置換は簡単にできるので（1週間かからない）、Refseqにした方が気持ち的には安心かもしれませんね。

クローニングしたcDNAのポイントミュテーション 削除/引用 No.3276-1 - 2014/08/05 (火) 18:30:25 - けむ 培養細胞(HeLa)から逆転写PCRを使用してクローニングした遺伝子のシークエンスを調べたら、１箇所ポイントミューテーションがありました（アミノ酸も変化してます）。比較した配列はRefseqのシークエンスです。ですが、BlastでESTクローンで検索すると、同じポイントミューテーションをもったESTクローンがありました。培養細胞に過剰発現して免疫沈降や局在の解析に使用する予定ですが、この場合、みなさんはvariantの一つだと考えてそのまま使用しますか？ それともRefseqと同じ配列に直して実験に使用すべきですか？ 宜しくお願いします。

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