BioTechnicalフォーラム [PI3K-Akt経路について]

PI3K-Akt経路について

No.3251-TOPIC - 2014/07/29 (火) 05:05:48 - まちゃ

初投稿させて頂きます。
PI3K-Akt経路に関して質問させて下さい。
ウェスタンブロッティングでAktのリン酸化が抑制されていた際に，その上流であるPI3Kの活性をみようと思っているのですが，その際に調べる必要があるのは，Total PI3K(P85)とリン酸化PI3K(P85/P55)の両方になるのでしょうか？それとも，Total PI3K(P85)のみの検出で十分なのでしょうか。論文を拝見していると，リン酸化PI3Kの抗体は使用せずに，Total PI3K(P85)のみをウェスタンブロットで検出して，PI3K-Akt経路に関してディスカッションしているものがあり，混乱しています。例えば，Total PI3K(P85)が減っている場合は，リン酸化PI3Kの活性を検出しなくても，Aktのリン酸化が抑制されるということが議論できるのでしょうか？
質問内容がわかりにくくて申し訳ありませんが，宜しくお願い致します。
　

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No.3251-10 - 2014/07/30 (水) 09:14:46 - まちゃ

すみません，解決アイコンを押し忘れました。これをもって，解決とさせて頂きます。お二人とも，繰り返しになりますが，本当にありがとうございました！

(無題)

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No.3251-9 - 2014/07/30 (水) 09:12:41 - まちゃ

おおさん，Ｌさん，お二人とも私の質問に丁寧に答えて頂きありがとうございました。とても助かりました。お陰様で，PI3K-Akt経路に対する考えが深まったと思います。お二人のご指摘頂いた，コメントを参考にしながら，もっと勉強して色んな側面から考えるように致します。本当にありがとうございます！

(無題)

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No.3251-8 - 2014/07/30 (水) 03:05:21 - L

p85のリン酸化といっても色々あるわけで、SH2ドメイン内のセリン残基のリン酸化の場合は、標的との結合を阻害すると言われてますね。チロシンの場合はリン酸化により相方のp110の活性を増強すると言われていますが、PI3Kの基本に立ち返ると、まずは膜へのリクルートではないかと。PI3Kの場合、基質が普通のタンパク質ではなく膜に局在するリン脂質なので、膜にリクルートされなければ、キナーゼ活性そのものの意義が？です。

AKTのリン酸化が抑制される事により生存や増殖が阻害される細胞が存在する事は間違いないと思いますが、このAKTリン酸化の抑制がPI3Kからのシグナルの減弱によるかどうかをtotal p85の発現量やリン酸化で判断するのはちょっと抵抗があります。AKTはPIP3により膜にリクルートされた後、PDKやmTORC2（他にも色々）によりリン酸化されるので、これらのキナーゼ経路の異常によりPI3Kとは別経路でAKTを抑制する可能性が否定できないからです。ただ、一般にAKTのセリン473のリン酸化はPI3K活性と良く相関すると言われていますので、セリン473のリン酸化が抑制されている場合は、上流のPI3Kから考える事自体は理にかなっていると思います。

(無題)

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No.3251-7 - 2014/07/30 (水) 01:00:45 - おお

>[Re:6] まちゃさんは書きました :

> 最後にお聞きしたいのですが，PI3Kのリン酸化を介しない，PIP3の生成，Aktのリン酸化という経路は，存在するのでしょうか？もちろん細胞種にもよると思うのですが。お時間があるときにご教授頂けましたら幸いです、

rasからの経路はp85 independentという記述をみかけましたが。。。

私も詳しくないので最近の総説を複数見ることをおすすめします。

> ＞おおさん
> 丁寧なご回答ありがとうございます。
> なるほど，Total PI3Kの変化でリン酸化Aktへの経路を説明する場合は，Lさんもご指摘して頂いたように，膜タンパクを抽出するのが望ましいということですかね。何となくですが，PI3K-Akt経路に対する考え方がわかってきたような気がします。ありがとうございます。

これも可能性の問題で、p85が膜貫通リセプターなどの活性化により、リクルートされ、チロシンリン酸かが起こり、p110に結合してそこで活性を発揮するというpathwayが知られているというわけで、じゃあすべてがそうかというと知られてないということはないということじゃないので、それだけでもって下流のシグナルすべてを語るのに不安を感じるわけです。実際に下流が動いていて、そのpathwayを通る何らかの示唆があって、リン酸かしたとか、膜に移行したとかいうのであればdiscussionはできるわけで、もしリン酸かや膜移行がなくても、活性化、その下流が動くという実験があれば活性化しているのだからそこからのシグナルは動いていることは十分いえるわけです。

そういうことを考えながら総説など当たってみてはどうでしょうか。

(無題)

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No.3251-6 - 2014/07/29 (火) 21:24:27 - まちゃ

＞おおさん
丁寧なご回答ありがとうございます。
なるほど，Total PI3Kの変化でリン酸化Aktへの経路を説明する場合は，Lさんもご指摘して頂いたように，膜タンパクを抽出するのが望ましいということですかね。何となくですが，PI3K-Akt経路に対する考え方がわかってきたような気がします。ありがとうございます。
最後にお聞きしたいのですが，PI3Kのリン酸化を介しない，PIP3の生成，Aktのリン酸化という経路は，存在するのでしょうか？もちろん細胞種にもよると思うのですが。お時間があるときにご教授頂けましたら幸いです、

(無題)

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No.3251-5 - 2014/07/29 (火) 11:58:42 - おお

>[Re:4] まちゃさんは書きました :
>TotalのPI3K(p85)が減っている場合，それに続く，Aktのリン酸化は，それに対応して減る，という考えはあっていますか？質問が続いてしまい申し訳ありません。宜しくお願い致します。

Aktのリン酸化が減っていて、かつPI3Kの活性が落ちているあるいはPI3Kのカスケードが効いているエビデンスなどがあって、PI3K(p85)が減っているのであれば、それは一つの示唆的なデーターです。

またどのぐらい減っているんでしょうか。1/10ぐらいになっているなら説得力がでてきます。

MAPKなどでも、totalの量が極端に減っているにもかかわらず、リン酸かフォームが絶対量で増えている場合もあるので、totalの量が半分ぐらいになったとかだけでは弱いです。リセプターなどを介しているなら膜へのリクルートメントぐらいは見ておいた方がよくないですか?それならリン酸か抗体はいりませんから。

(無題)

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No.3251-4 - 2014/07/29 (火) 11:19:01 - まちゃ

>おお　さん
ご回答ありがとうございます。PIP2基質を利用したELISAキットも売られているようです。確かにPI3Kの活性を定量化するのが，確かに一番大事なことですよね。ウェスタンブロットの方がコストの面でリーズナブルなので，何とかウェスタンブロットで議論したいと考えておりました。ELISAでの活性の検出も検討したいと思います。ありがとうございます。

＞L　さん
ご回答ありがとうございます。なるほど，p85リン酸化の度合いが，PI3Kの活性，さらにはAktのリン酸化の度合いにつながるわけでは，必ずしもないということですか。拝見していた論文では，ウェスタンブロットを用いて，「ある刺激に対して，TotalのPI3K(p85)の発現量には差はないが，リン酸化PI3K(p85)の発現量に差が生じ，それがAktのリン酸化の差，最終的には細胞増殖の差につながる」のような議論をしているように見えました。このあたりは細胞の種類，刺激の種類などのケースによるということですかね。TotalのPI3K(p85)が減っている場合，それに続く，Aktのリン酸化は，それに対応して減る，という考えはあっていますか？質問が続いてしまい申し訳ありません。宜しくお願い致します。

(無題)

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No.3251-3 - 2014/07/29 (火) 08:22:07 - L

PI3Kの活性が見れればそれで十分ですが、p85のリン酸化でPI3Kの活性を評価できるかどうかが問題かもしれませんね。p85のリン酸化部位によってRTKやIRS1との結合への影響も様々ですので。活性を評価する方法の一つとして、直接の基質であるPIPのリン酸化（PIP3）を見る方法があると思います。コンパートメント（膜へのリクルート）でも評価可能と思われますので、膜蛋白を分離すればtotal p85のウエスタンでも議論可能かと思います。

(無題)

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No.3251-2 - 2014/07/29 (火) 05:34:04 - おお

>[Re:1] まちゃさんは書きました :
> 初投稿させて頂きます。
> PI3K-Akt経路に関して質問させて下さい。
> ウェスタンブロッティングでAktのリン酸化が抑制されていた際に，その上流であるPI3Kの活性をみようと思っているのですが，その際に調べる必要があるのは，Total PI3K(P85)とリン酸化PI3K(P85/P55)の両方になるのでしょうか？

活性を調べたら、それで一段落ではないでしょうか。だって活性がout putですから。ただcatalytic subunitはつねに活性があるんじゃなかったでしたっけ。

>例えば，Total PI3K(P85)が減っている場合は，リン酸化PI3Kの活性を検出しなくても，Aktのリン酸化が抑制されるということが議論できるのでしょうか？
> 質問内容がわかりにくくて申し訳ありませんが，宜しくお願い致します。
>

議論はできます。議論の材料としてどこまであつめるかということだと思います。あとほかの実験との兼ね合いもありますでしょうし。

PI3K-Akt経路について

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No.3251-1 - 2014/07/29 (火) 05:05:48 - まちゃ

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