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(無題) 削除/引用 No.3248-21 - 2014/07/30 (水) 11:05:02 - asn お礼が遅くなってしまい申し訳ありません。 ご意見、ありがとうございます。 定量ということから考えるとFCMの方が正確とのことで、一度FCMで解析することも考えてみたいと思います。 また、局在の検討についてはこのまま顕微鏡で確認することにします。 どちらの実験を行うにしても、まず前提として、手技のぶれ・染めムラを一度調べるために比較的容易しやすい別のsampleで数回トライしてみたいと思います。 染めムラが比較的軽度であれば次のステップとして比較実験に行きたいと思います。 皆さんからのご指摘とても参考になりました。 知識不足のため頭がパニックになってしまい、不十分な回答や、意固地になってしまったことをお許しください。 修論に向けてまた頑張ります。

(無題) 削除/引用 No.3248-20 - 2014/07/29 (火) 17:08:47 - ~ FCMならば、検出系部分については比較的安定な結果が期待できますが、 ICCでは、手技によるブレを拾う可能性がFCMよりも高い上に、比較的少数の細胞のタンパク質発現量しか見れませんよね。 それでも、FCMでではなくスライドガラス上でのタンパク質量の定量を優先して検討するメリットはあるのでしょうか？ Mitotrackerでなくとも、 �@目的のタンパク質を認識する蛍光抗体 �Aソート用のGFP �B試験区の片方を識別するための蛍光抗体 の3色で染色・測定できれば目的の検出ができますよね。 事前に�Bで一方の試験区の細胞を染色した後で1チューブに混ぜて�@で染色し、FCMで�A＋�B＋と�A＋�B−のそれぞれの細胞群の�@のシグナルを定量するか、 �A＋の細胞をソートした上で、蛍光顕微鏡で�B＋、�B−のそれぞれについて�@のシグナルを定量してはいかがでしょうか。 �Bの標識をそれぞれの試験区で行えば、�Bの蛍光による影響を排除できるでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3248-19 - 2014/07/29 (火) 15:22:23 - おお ムラが問題というけれども、試しにその細胞じゃなくてもいいから、同じ細胞を何回かに分けてそめてどれだけ差が出るみてみたら?FCMにしても顕微鏡にしても。 なにかインターナルコントロールになる細胞が一緒に混じっていたとしても、ここの細胞でシグナルの強さも変わってくるし、、、まあ数十個平均とればというかもしれませんが、、、、 あとフィーダーだって薬剤処理されて動くかもしれませんね

(無題) 削除/引用 No.3248-18 - 2014/07/29 (火) 15:07:29 - flowjoe M2といことで先輩方の意見に影響されている様ですが、はっきり断言すると、定量と言う観点では抗体の特異性がしっかりしているかぎり顕微鏡よりFCMの方が良い。染めムラを気にしているようだが、そうなると顕微鏡は論外。 細胞数が少ないとのことなので、ソートしてから染めるのではなく、全細胞を固定してGFP、赤（定量したいタンパク）,deep red(alexa647など)分取した細胞集団で特異的に発現するタンパクを染色し、FCMを行ってGFPやdeep redでゲートをかけてその集団の赤のエリアを解析するのが良さそうです。局在は、その細胞をソートしてきて顕微鏡観察。インターナルコントロールをどうしても欲しいなら再現性を確認したら、抗体の組み合わせを変えて解析すれば良い。インターナルコントロールのデータは、問われた時にサプリで出すので良いと思う。 細胞質に存在するGFPでも固定すれば流出を防げます。

(無題) 削除/引用 No.3248-17 - 2014/07/29 (火) 14:49:25 - MP サンプル間のムラが問題ということだけど、だからこそFCMのほうがベターなのでは、、、。 それこそn=10000とかの比較になるわけで。 ただFCMで解析する場合、HeightよりAreaの値を比較するほうがよいと思うので、それなりの機種が必要だと思いますが、ソートができるのであれば問題ないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3248-16 - 2014/07/29 (火) 14:12:34 - おお mitotrackerで10分ぐらい培地に加えてインキュベーションして固定してもなまでも見れるものがあるよ。

(無題) 削除/引用 No.3248-15 - 2014/07/29 (火) 13:53:21 - asn みなさん、たくさんのご意見ありがとうございます。 まずFCMで解析する件です。 教授と話し合ったのですが、強度の比較という点では2sample間にムラが出てしまうので、結局蛍光顕微鏡で見ているのと変わらないのでは？というお言葉を頂きました。 これを無視してn数を増やすことで有意差を得て示す、ということも考えたのですが、説得力に欠けるとのことでした。 このタンパクについてはこれまでqPCRでmRNA量を定量しており、有意差を得られています。 しかし劇的な変化ではなく、このためタンパク量も劇的な違いがあるわけでは無いことが予想されます。 このため、染色時の強度のムラが反映されてしまうと困るわけです。 次にセルトラッカーで細胞を染め分けて、2sample混ぜてスライドに張り付けるというご意見です。 調べてみたのですが、セルトラッカーは固定に向かないとのことでした。 またそれ以外のオルガネラを色づけする試薬も見てみたのですが、固定ができなかったり、処理時間がovernightだったりと、実験系にあまり適しておりませんでした。 ご紹介いただいたのに、申し訳ありません。 そして細胞数について。 私の実験系ではマウスの胚から必要な細胞集団を取ってきますので、何胚得られるかという問題になるのですが、少なくて1500細胞、多くて30000細胞程度です。 10000細胞以上とれることは稀です。 最後に。 私の定量したいタンパク抗体（赤）でこの染まりムラを補正すべきなのだと思います。 このため全く別の細胞を（または培養時に共培養していたfeeder細胞を）共に染めて、その細胞で赤の補正を行うのがベストでは？との意見を頂いています。 どうでしょうか… ご意見お願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3248-14 - 2014/07/29 (火) 13:29:34 - AA IHCの話なのでICCのケースとはまた違うとは思いますが、 既報を真似して蛍光染色の結果を定量して投稿したところ、 その方法では定量性が不確かなのでWBなどでやり直せ、 と、レビュワーに言われたことがあります。 定量の実験と局在確認の実験を別個にやるという選択肢はないのでしょうか？ 顕微鏡下での蛍光強度でより正確な評価を議論する、 という流れには反する意見かも知れませんが、、、、

(無題) 削除/引用 No.3248-13 - 2014/07/29 (火) 13:04:22 - おお GFPは固定で流れ出すんじゃなくっておそらく蛍光活性が低下、消失してるんだと思いますねぇ。。。なのでGFP抗体をつかってFCMというのは妥当と思えますけど、、、 まあいちおう顕微鏡でなるべく厳密な比較をしたいということなので、顕微鏡でのプロとコールで知恵を絞り出してますけど。 細胞は数として何個ぐらい取れるんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3248-12 - 2014/07/29 (火) 11:36:03 - ふろ GFPは固定すると蛍光が見づらくなるだけでタンパク質自体はあるので、抗GFP抗体で染めてもいいと思うのですが。細胞内のタンパク質は固定作業によって細胞外に流出するものでしょうか。 むしろ、細胞を固定して 1. 抗GFP抗体 2. 目的の定量したいタンパク質 で染色した細胞をFCMにかければ、一度で済むと思います。 発現量の比較はFCMでできますよね（そのための装置な気がします）。 局在に関しては、どうしても顕微鏡下で行うことになります。 IN Cell AnalyzerなどのHCSの装置があればFCMの代わりに培養した細胞をそのまま使えそうです（GFP陽性細胞が多ければ）。

(無題) 削除/引用 No.3248-11 - 2014/07/29 (火) 11:19:25 - flowjoe FCMで定量で問題ない。 ピークやら平均やらを比較して差が出ればよい。 定量性の問題は再現とれれば良いと大抵の人が思っているはず。 局在は別に顕微鏡で見ればよい。 あと、ソートができるようなFCMがあるのなら3色いけない？ 不安なら、コントロールを追加した3色でやればよい。 顕微鏡での定量って、Z軸の問題があるから低倍、低NAで撮影して重なりが無い状態でやってもFCMより劣ると思う。

(無題) 削除/引用 No.3248-10 - 2014/07/29 (火) 10:42:38 - おお https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/C2925 こういうのがありますから、処理している方、していない方違う色でlabelしておいて同じスライドガラスに乗っけるというのはどうでしょうか。ちょっと強すぎるかもしれないのでかぶらないように何らかの工夫が必要かもしれませんけど。 ラベル後固定できるか調べてないですけど、同じような商品も出回ってますし。。。 GFPが固定後強いようでしたらちょっとやりにくいですけど、これでラベルするまえにブリーチングすればいいかな。。。それかlipidに色素をつけたにた商品があったような気がする。それだと細胞膜だけラベリングされるのでわかりやすいかもしれない。 ラベルが100%と確認できるなら片方だけラベルすればいいので、青だけ使えばいいかもしれないし。 核は微分干渉かなんかで位置を確認するとかにすれば染色はいらないかもしれないし、詳細の局在と、発現量は分けて実験してもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3248-9 - 2014/07/29 (火) 10:04:37 - よっしー 蛍光顕微鏡での定量よりはフローサイトメーターでの定量の方がはるかに定量性があると思うのですが・・・ 私は蛍光顕微鏡での定量に否定的なのでそう思っているだけなのかぁ？ 一般的にはどうなのでしょう？

(無題) 削除/引用 No.3248-8 - 2014/07/29 (火) 09:58:54 - asn ふろさん ありがとうございます。 固定してもフローはできますよね。 すみません、私のミスです。 FACSで蛍光強度を解析すればよいとのことですよね。 ですが結局強度の比較という問題は解決しないように思うのですがどうでしょうか。 教えて頂けますと幸いです。 また、私の実験では同時に局在も見たいと思っておりますので、できれば顕微鏡で見たいと思っております。 知識不足で申し訳ありません。

(無題) 削除/引用 No.3248-7 - 2014/07/29 (火) 09:46:53 - ふろ > 皆さんからご指摘いただいたフローサイトメーターですが、ソートしてからの染色なので使用できません。 あまり詳しくないのですけど、これはなぜでしょう？ ソートした細胞を固定して染色してフローにかけると問題があるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3248-6 - 2014/07/29 (火) 09:34:51 - asn みなさんご意見ありがとうございます。 私の説明が不十分だったようで、申し訳ありません。 実験方法を詳しく書きたいと思います。 �@GFP蛍光を持つように遺伝子操作した細胞群をマウスより取り出す。 �Afeeder細胞上で48時間培養（この時薬剤の添加の有無をつける） �BフローサイトメーターでGFP＋細胞のみを分取 �Cスライドに張り付ける �D免染 　・分取した細胞集団で特異的に発現するタンパクを緑で染色 　　（固定でGFPが流れてしまうため） 　・定量したいタンパクを赤で染色 　・DAPIで核染色 緑の蛍光はマウスの個体差が出やすいタンパクなため、補正には使えません。 皆さんからご指摘いただいたフローサイトメーターですが、ソートしてからの染色なので使用できません。 この実験の目的は赤で染めたタンパクの発現量の比較を行いたいということです。 問題点を以下に示します。 ・細胞数が少ないため、WBはできない ・別のスライドガラスに張り付けるので、手技上sample間で蛍光強度に微妙な差が出てしまうことが考えられる 現在β-actineなどのメジャーなタンパクで補正をかけることを考えていますが、三重染色に不安があります。 この方法以外に何かアイデアを頂けますとありがたいです。 よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3248-5 - 2014/07/29 (火) 08:04:52 - 独り言 そのまま免疫染色したサンプルで写真撮影して、蛍光強度を定量すればいいと思う。他のタンパク質の染色ではインターナルコントロールにはならないでしょ。例えば、核が同じくらいの大きさに見えるようにZ軸が同じ位置で取るように工夫するとか、その目的タンパク質がもっとも明るく見えるZ軸で撮るように統一するとか、染色にしようする細胞数を統一するとか、細かいことに気をつければ。N数を増やして、優位さあれば、とりあえずいいのでは。 見た目であきらかに蛍光強度に違いあるなら絶対できる。見た目で微妙なものは、かなり気をつけないと、差がばらつく。 でもサイトメーターがつかえるのであれば、それが一番楽だと思うけど。

(無題) 削除/引用 No.3248-4 - 2014/07/28 (月) 23:13:10 - おお 色の被りが少ない色素で見たいやつをそめたいから、ものは赤かfarRedのほうがいいかな。

(無題) 削除/引用 No.3248-3 - 2014/07/28 (月) 22:52:26 - おお >・培養細胞群からある細胞集団をソートで分取 この時にすでに染色が施されているのですよね。その時の色を一方の実験は赤、他方を青でそめて、見たいものを緑で染めると、両者を混ぜてスライドに乗せても判別がつきますよね。 念のため色をswapして同様の結果が得られるか確認するべきとは思いますけど。 ただインターナルコントロールにしろ混ぜるのはちょといやだなぁと科学的でないところで違和感があります。。。

sort 削除/引用 No.3248-2 - 2014/07/28 (月) 20:33:03 - flowjoe ソートと書いてありますがフローサイトメーターを使っているのであればそれで良いのでは？

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