>>monさん
>相当なお金持ちなら、デジタルPCRかな?
相当お金がありません(笑)。ですが、デジタルPCRは、技術的にベストかも知れませんね。
>>APさん
>調製したDNA溶液の中に標的遺伝子が実際に何コピーあるかを知りたいだけだということですね。サンプル間で抽出効率の違いや希釈率の違いがあったとしても問題ではなく、内部標準的なもので補正して、ある単位あたりのコピー数で標準化するとか、そういうことは考えなくていいと。
おっしゃる通りです。
>おおさんの言っているのは、先に挙げた(2)のように、植物体ゲノムのコピー数を内部標準として、葉緑体ゲノムのコピー数を標準化する(植物体ゲノム1あたり葉緑体ゲノムが何コピー含まれているか)ということのようです。ゲノムとは何のゲノムを指しているのか云々、の疑問はそこんところの行き違いでしょう。おおさんのおっしゃるとおり、そういう事をするなら濃度既知のコントロールDNAを標準として使用します。PCRで増幅される配列を含むクローン化DNA、またはPCR産物そのものを使います。
すいません。まだ、当方のゲノムの定義が一致していません。植物体ゲノムとは、1細胞内の核ゲノム+葉緑体ゲノムということでしょうか?
また、濃度既知のコントロールDNAとは、本植物の核ゲノム内のハウスキーピング遺伝子のコピー数が既知のサンプルということでしょうか?
>>おお さん
>精製はゲルから切り出しするのが一般的です..........
限外濾過やゲル切りで、増幅産物を回収したものを使用してコピー数を求めることは、ロジックとしては正論だと思いますが、実際の回収率のバラつきを考えると、論文等でディスカッションできる程の現実性に欠けるように思います。当方で、同様のことを行っている論文を検索しましたが、認められませんでした。以上のことから、本法は、現実的では無いのでしょうか?
>>かしの木 さん
コメントありがとうございます。 |
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