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(無題) 削除/引用 No.3240-4 - 2014/07/31 (木) 02:48:52 - V 中西部ポスドク様、--様、 大変参考になりました。 有難うございます。 プライマリー細胞を用いてのノックアウトは難しいのですね。 MOIを大きくしても良いからノックアウトの効率を上げたい（90%くらい）と考えていたのですが難しそうです。 別の阻害剤などの系を検討してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3240-3 - 2014/07/29 (火) 18:25:02 - - Cas9を導入するためのレンチウイルスは、インサートのサイズが大きくなるため 導入効率が著しく下がってしまうようです。 High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells では、先にCas9陽性の細胞を作製してからライブラリーを入れてるのではないでしょうか。 All-in-oneのpLentiCRISPRを使ってヒト培養細胞にCas9, gRNAを導入すると、 セレクション前の状態でかなりの高確率でミューテーションが入った細胞が取れるようです。 しかし、うまくいくかどうかはgRNAの配列によるようで、1つの遺伝子に対し3つのgRNAを 試したのですが、１つしかうまくいきませんでした。 また、培養細胞でうまくいったレンチウイルスをプライマリーの細胞で試すと、 Cas9陽性の細胞がほとんど見られませんでした。 現時点ではプライマリーの細胞でAll-in-oneのレンチウイルスを使用するのは 難しいのではないでしょうか。

私も興味があります。 削除/引用 No.3240-2 - 2014/07/29 (火) 04:16:59 - 中西部ポスドク High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells　（Nature2014）によると、HelaとHEKを用いた場合で9-55%ぐらいとのことです。Cas9のコピー数は関係ないとのことでした。 Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.（Science 2014）を見る限りは相当高そうに見えるのですが。 私の同僚もトライしましたが、陽性クローンが取れませんでした。 どなたか経験のある方はいらっしゃいませんか？

レンチウイルスCRISPRの正常細胞での効率 削除/引用 No.3240-1 - 2014/07/25 (金) 08:28:32 - V お世話になっております。 レンチウイルスおよびCRISPR/Cas9に関して質問がございます。 この度レンチウイルスベクターにCRISPRを組み込んだ融合ベクターを用いて、正常T細胞のノックアウトをしたいと考えております。もし詳しい方がおりましたらご教授頂けると幸いです。 効率について。 どなたか正常細胞にこの系を用いた方はいらっしゃいますか？ 細胞種にもよると思うのですがノックアウトの効率は何％くらいなのでしょうか？MOIを高くすれば高くするほどノックアウト効率は上がると思いますが、細胞毒性との兼ね合いもあります。ご経験がございましたらお教え下さい。

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