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(無題) 削除/引用 No.3226-18 - 2014/08/10 (日) 06:07:10 - おお フィードバックありがとうございます。加熱によるアグリげーしょんが原因のようでしたね。低温処理のときは、b-ME還元剤の作用が行き届かない懸念が指摘されることがあります。もしその様な感触がありましたらDTTなどより強い還元剤をお使いになれば改善の見込みがあるかもしれません。

お答えを頂戴した皆様 削除/引用 No.3226-17 - 2014/08/08 (金) 13:38:06 - V2R 4℃でover nightすることでかなり改善することが分かりました。 皆様のアドバイスに感謝申し上げます。 また教えていただくこともあるかと存じますが、その際にはどうぞよろしくお願い申し上げます。

(無題) 削除/引用 No.3226-16 - 2014/07/23 (水) 02:18:27 - おお ちなみに蛋白用の尿素は要事調せいが好ましいと個人的に思ってます。

>おお様 削除/引用 No.3226-15 - 2014/07/22 (火) 21:00:44 - V2R >おお様 何度も丁寧に有難うございます。 ラボの尿素が空だったので(汗)、残念ながら今回はできませんでした・・・。4℃O/Nで駄目なら次に試させていただきます。有難うございます。 また、他の細胞株も探してみたいと存じます。

(無題) 削除/引用 No.3226-14 - 2014/07/22 (火) 16:35:25 - おお COSであればT antigenによりpCNDAが細胞内で複製されて細胞内のコピー数が非常に高くなりますので、プラスミドの発現ユニットの部分だけ切り出してtransfectionするとか、、、HEK293はT antigenないんだけどHEK293Tははいってますね。ただHEK293はそれでもかなり入りやすい細胞ですので。 まあベクターからきりだすとかまどろっこしいことするよりはその遺伝子が発現している組織や癌から株化したものでtransfectionである程度入るものであればそういう細胞に変えるのも手かもしれません。 >煮沸せずにover nightその後SDS-PAGEという流れで一度やってみたいと思います。 飽和尿素も同時に同じけるに流せるならやってみればどうですか?

>おお様 削除/引用 No.3226-13 - 2014/07/22 (火) 15:29:06 - V2R 何度も丁寧なアドバイスを頂戴し有難うございます。 すみません、十分読めてませんでした。一旦、sample bufferを入れて、煮沸せずにover nightその後SDS-PAGEという流れで一度やってみたいと思います。

>mon様 削除/引用 No.3226-12 - 2014/07/22 (火) 15:25:00 - V2R >mon様 有難うございます。 なるほど・・・・。 ダミーという手もあるのですね。もう少し進めてみてうまくいかなければ検討させていただきます。また、今後stableも作ることも考えておりますので、その際に参考にさせていただきます。

(無題) 削除/引用 No.3226-11 - 2014/07/22 (火) 11:10:03 - おお えっとV5でまずはいいかなと。質問の意図は違う抗体でも検出されるかとかそう言うことだったんですが、ただHISはのんすぺが多すぎるので、WBしても当てにならないかもしれません。 糖さ修飾ちらっと探した感じでは、10kDaぐらいのシフトで100kDaとかに至ってないような感じですね。ただしプロセッシングの途中で過剰発現ためスタックしていたりというのは可能性として否定できませんけど。 2、3の論文で75kDaぐらいから高分子側ですめあーひいているものを見かけましたが原因まではチェックできませんでした。 7回貫通のこの手の蛋白はたしかに、非常に疎水性がつよくって、SDS sample bufferでボイルの時あぐりやすいという話はきいたことがあります。

(無題) 削除/引用 No.3226-10 - 2014/07/22 (火) 11:09:37 - mon もしユビキチン化が原因なら、それを防ぐのは困難です。 発現量を減らすしか方策はないかも。 一過性発現なら、plasmid量全体量は一定にして、ダミーplasmidを混入するとか（成功するか否か不明）でしょうか。 あるいは、弱めのpromoter(HSV-tkとか？）を載せたlentivirusで、安定発現細胞を調製するとか、でしょうか。 あるいは、薬剤で誘導発現するpromoterを利用し、薬剤濃度を調整するとか。。

>おお様 削除/引用 No.3226-9 - 2014/07/22 (火) 10:22:37 - V2R たびたび有難うございます。 このコンストラクトのtagに対して使えるものとしてはV5抗体、HIS抗体を保有しております。現在V5抗体を使ってWBを見ていますが、たまたま他の実験でもV5を使っているためだけで、特に理由はありません。

>ねずみ様 削除/引用 No.3226-8 - 2014/07/22 (火) 10:20:37 - V2R >ねずみ様 丁寧なアドバイスを頂戴し有難うございます。 他の７回膜貫通型受容体のpaperやN-glycosidase処理につきまして検索させていただきたいと存じます。

>mon様 削除/引用 No.3226-7 - 2014/07/22 (火) 10:17:55 - V2R >mon様 アドバイス有難うございます。 トランスフェクションの時間、量を減らしたり、ユビキチン化を阻害するような薬剤を使ってみればよいということでしょうか？ 差支えなければ、対応策をご教授いただければ幸いに存じます。

(無題) 削除/引用 No.3226-6 - 2014/07/21 (月) 12:34:44 - おお ところで抗体は何をお使いでしょうか、、、複数のWBで使える抗体をお持ちでしょうか。。。

(無題) 削除/引用 No.3226-5 - 2014/07/21 (月) 12:22:11 - ねずみ 糖鎖修飾でしょうね。 他の７回膜貫通型受容体のwestern blottingの論文報告がありますから、それを参照して下さい。 N-glycosidaseで処理するとバンドがシフトするという報告もありますので、検索してみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3226-4 - 2014/07/21 (月) 09:23:26 - mon 過剰発現が原因で正常にfoldingされていないタンパクがユビキチン化を受けているのではないでしょうか？

>おお様 削除/引用 No.3226-3 - 2014/07/20 (日) 16:00:11 - V2R >おお様 丁寧なアドバイス頂戴し有難うございます。 目的のバンドも一応は出てはいます。ただ、スメアは高分子側に引いており、約100kDaの部分より上に出続けていて、重い質量の部分ほど濃く写っている状態です。 一度室温で処理することや飽和尿素についても検討させていただきます。

(無題) 削除/引用 No.3226-2 - 2014/07/20 (日) 14:57:30 - おお アグリゲーションが問題であれば、SDSサンプルバッファーを混ぜてから煮沸しないとかで解決する場合があるようです。50-60度で処理するとか、室温で長めに処理するとかいろいろ蛋白、人によって方法論があるようですけど。 または尿素を使うことによってアグリゲーションをふせぐ、あるいはほどくというのが可能な場合もおおいでしょう。方法論的にはいろいろ考えられますが、尿素存在下でボイルすると蛋白と尿素でコンプレックスができてしまうようなので、わたしはサンプルバッファーで処理後同量の飽和尿素を加えることもあります。 そのそのスメアーは高分子側にくるのでしょうか、、、糖鎖修飾はからんでないでしょうか?低分子側ならアグリゲーション以外のにも原因があるかもしれません。

V2受容体 削除/引用 No.3226-1 - 2014/07/20 (日) 12:54:26 - V2R いつも勉強させていただいております。有難うございます。 バソプレシン受容体(V2)の解析を始めようと考えている者です。 pcDNA3.1-V5HISにAVPR2を導入し、トランスフェクションを行ってlysateを用いてWBなどを行いたいと思っております。 WBを行い発現を確認すると、目的のバンドサイズ以外にもスメアを引いてしまっており、何らかのアグリゲーションなどが起きているのではないかと思っております（COS7とHEK293でやってみましたが、いずれも同じような結果でした）。 膜蛋白を扱うのが初めてなので（周囲にも居らず）、どのようにしたら改善するかが分かりません。 実験初心者でして拙い質問で申し訳ありませんが、抽出方法(bufferの組成や手法など)アドバイスがありましたらご教授いただければ幸いです。

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