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(無題) 削除/引用 No.3215-20 - 2016/03/07 (月) 21:34:36 - Ano 以前に、別の脂肪酸の添加実験をしたときは、ナトリウム塩を 使っていました。 ステアリン酸ナトリウムは、、、とても高いので、ステアリン酸 カリウムではどうでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3215-19 - 2016/03/07 (月) 15:02:53 - おお リポソームとか使えば状況が変わるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3215-18 - 2016/03/07 (月) 05:51:27 - 素人です。 > BSAを添加するのは脂質を溶かすには良い方法でよくやっていますが（1~5%程度），脂肪酸は溶液中に溶けてはいますが，細胞へ取り込まれる量は低くなります。RIラベルで脂肪酸を細胞を取り込ませる場合（final 数百nM~数uM程度），BSA添加の場合，直接培地中に脂肪酸を加えたものに比べて取り込み量は減ってしまうというデータを得ています。 脂肪酸を血清フリー培地（Opti-MEM1など）に添加したもので細胞を培養すると、脂肪酸は界面活性剤でもあるので、細胞が死んでしまうというのはわかります。 なので、血清フリーの培地で脂肪酸の細胞に与える影響を見ようとするとトピックの内容にもありますように、BSAをキャリアにすると論文でみました。 ただ、BSAをキャリアにすると、「直接培地中に脂肪酸を加えたものに比べて取り込み量は減ってしまうというデータを得ています。」ということのようですが（これは実は私も経験があるのですが）、BSAを添加しないと細胞が死んでしまう、でもBSAを添加するとそもそも脂質の取り込みが悪くなる、という状況をどう打開すべきか悩んでいます。BSAをキャリアにした場合でも脂肪酸は遊離型に解離したり、などの平衡状態を保っているのでしょうか？BSAキャリアでも細胞にとっては利用できる脂肪酸になるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3215-17 - 2014/07/19 (土) 22:49:24 - 脂質関係者 フィルターに関して記載し忘れましたが、フィルターの素材はPESのものを使っています。 各社のフィルターカタログにBSAの吸着については各素材で比較したデータがのっていると思います。PESはBSAの吸着は低いようです。

(無題) 削除/引用 No.3215-16 - 2014/07/19 (土) 22:37:50 - 脂質関係者 滅菌に関しては難しいところです。ガラスチューブはオートクレーブ、BSAを溶かした培地をフィルター滅菌し、ストック脂質（in DMSO）を入れているだけです。DMSOはフィルター滅菌をしています。 この方法だと脂質への微生物のコンタミが気になる方もおられるでしょうが、わたしの実験では細胞に脂質を加えている時間は数時間で、その後細胞から脂質または蛋白抽出しているため、脂質への微生物のコンタミはあまり気にしていません。また、この方法で作製した脂質入り培地を数日インキュベーターに入れてみましたが、微生物が増えることもありませんでした。これは用いる脂質？メーカー？によると思いますのでなんともいえませんし、ステアリン酸で試したことはありません。 微生物の影響を気にするのであれば脂質を溶かした培地をフィルター滅菌したものと上記の方法で作った培地での結果を予備検討で比較するのが当然ベストだと思います。

教えてください 削除/引用 No.3215-15 - 2014/07/19 (土) 16:18:38 - プリン >[Re:14] 脂質関係者さんは書きました : > 脂質の解析をしています。 > じゃあどうすればいいのかということになりますが，100uMにしたいのでしたら1~5% BSA溶液に100mM ステアリン酸（in DMSO) を1/1000量加えて（この時おそらく水面に析出します。50mMを1/500倍量でも可），vortexと水浴型のsonicationを繰り返すのが良いかと思います。このときガラスチューブでやる方がベターです。ただ，この方法で作製した培地中の脂肪酸はBSA結合型，遊離型を含めて100uMとなっていることに留意してください。 滅菌の方法は何を採用されていますでしょうか？　濾過滅菌の場合は、フィルターの材質についてもご教授願いたく思います。　フィルターの材質によっては脂質、BSA脂質の吸着（フィルターハウジングの材質によっては、ハウジングへの吸着も気になるところです）が大きく左右されるかと思います。 　何か検討されたデータがありましたら、可能な範囲で書き込んで頂きますよう、よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3215-14 - 2014/07/19 (土) 11:45:43 - 脂質関係者 脂質の解析をしています。気になることがあったのでコメントさせて頂きます。 PYKさんの方法ですが，本当に溶けているのでしょうか？チューブはガラス製を用いていますか？プラスチック製のチューブでしたら壁にくっついてしまって粉っぽいものは一見見えなくなりますが，おそらく目的の濃度になっていないように思われます。たまに論文でもfinal 500uMでパルミチン酸を細胞に添加しているものをみかけますが，どうやって溶かしているのか気になっていました。そして細胞がそんな高濃度なパルミチン酸にさらされる機会が生体内であるのかどうかもちょっと定かではありません。 BSAを添加するのは脂質を溶かすには良い方法でよくやっていますが（1~5%程度），脂肪酸は溶液中に溶けてはいますが，細胞へ取り込まれる量は低くなります。RIラベルで脂肪酸を細胞を取り込ませる場合（final 数百nM~数uM程度），BSA添加の場合，直接培地中に脂肪酸を加えたものに比べて取り込み量は減ってしまうというデータを得ています。 じゃあどうすればいいのかということになりますが，100uMにしたいのでしたら1~5% BSA溶液に100mM ステアリン酸（in DMSO) を1/1000量加えて（この時おそらく水面に析出します。50mMを1/500倍量でも可），vortexと水浴型のsonicationを繰り返すのが良いかと思います。このときガラスチューブでやる方がベターです。ただ，この方法で作製した培地中の脂肪酸はBSA結合型，遊離型を含めて100uMとなっていることに留意してください。

(無題) 削除/引用 No.3215-13 - 2014/07/16 (水) 12:56:26 - おお ありがとうございました

(無題) 削除/引用 No.3215-12 - 2014/07/16 (水) 09:14:09 - なそり おお 様 そうですね。説明不足な上に変な日本語ですみません。 PYK 様からいただいた方法で、最終的に培地に添加する際10倍希釈するように作りました。 （100mM/DMSOを 5%BSA/PBSに1/100量加え、sonicaterと60℃湯浴を交互に。だいたい5分くらいかかったかと思います。） PBSの代わりに 5%BSA/10%FBS/RPMI 1640でも同じ方法でやってみましたが、こちらもきちんと溶けました。

(無題) 削除/引用 No.3215-11 - 2014/07/15 (火) 23:21:01 - おお 結局PYKサンの方法で10倍濃度のものを作ったのでしょうか。せっかくですから情報をシェアしていただけませんか?

(無題) 削除/引用 No.3215-10 - 2014/07/15 (火) 18:11:59 - なそり 返事が遅くなり、申し訳ありません。 TS 様 うっかりしていました。。。最終濃度と書いてあったので気づくべきでしたね。 折角の御意見を生かせずにすみません。 最初に濃い目に作ろうとしていたのは、この系で参考にしている論文でfinalが100uMで、かつなるべく細胞に添加する液量を少なくしたかったためです。 PYK 様 最初にDMSOに溶かすときは100mMでやってみましたが、うまく溶けました。 当方には棒状のsonicatorがないので、箱形の物を使用しましたが、箱形だとこれより濃い物は難しいようです。 アドバイスいただき、ありがとうございました。 おお 様 細胞飼ってる培地に直接は最初にやっていました。投稿する際に補足として書いておくべきでしたね。申し訳ないです。 ひとまずステアリン酸を溶かすことができましたので、解決とさせていただきます。 ご協力いただきました皆様、誠にありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3215-9 - 2014/07/14 (月) 22:52:08 - おお >[Re:6] なそりさんは書きました : > その後の経過をご報告します。 > 1% BSA（RPMI 1640/FBS 10%）にステアリン酸（顆粒）を100mMになるよう溶かしてみましたが、全く溶けませんでした。 > ああ、ごめんごめんストックはDMSOで溶かせば、、、そこからいきなり100uMになるように添加すればというつもりだったんですけど。。。

(無題) 削除/引用 No.3215-8 - 2014/07/14 (月) 19:51:23 - PYK 当方、ステアリン酸ではなくパルミチン酸の実験をやっていますが、相談にのれるかと思います。 （基本は同じ飽和脂肪酸ですので） まず、DMEM/BSA溶液に直接はおそらく溶けないと思います。 私はまず、500mMとなるようにパルミチン酸をDMSOに溶解。（これは一瞬で溶けるはず。そしてこの状態で-20ºCで保存可。） 5%BSA-PBS 10mLに、上記の500mMパルミチン酸を100µL（final 5mM）入れると、白濁して全く溶解しないと思いますので、私はsonicationと60ºCくらいの水浴で温める、ということを4-5回繰り返しています。 棒状のsonicatorで結構強めで30秒行った後、60ºCで20-30分温める、というサイクルで。 パルミチン酸なら、しばらくすると溶けます。 溶けたら、0.22µmでフィルター滅菌し、分注して-20ºC保存。 使用する時はDMEMに10倍希釈（final 0.5mM）して細胞に添加。 こんな感じですかね。 私はうまくいっています。

(無題) 削除/引用 No.3215-7 - 2014/07/14 (月) 18:08:03 - TS ミリじゃなくて、マイクロって書いたつもりでした。 100ミリは無理でしょう（濃いのつくらないとだめなのですか？？）。 文字化けしてたけど、最終濃度って書いたから大丈夫だろうと思ったのですが。。 一度はクロロホルムなどの有機溶媒とかに溶かさないと、なじまないと思いますが。 多分、ピッと入れて、すぐさまボルテックスかければ、いけるんじゃないかなぁ。

その後です。 削除/引用 No.3215-6 - 2014/07/14 (月) 17:54:37 - なそり その後の経過をご報告します。 1% BSA（RPMI 1640/FBS 10%）にステアリン酸（顆粒）を100mMになるよう溶かしてみましたが、全く溶けませんでした。 ダメもとで60℃で湯浴もしてみたのですが、これでも溶けませんでした。 引き続き、何か方法を知っている方がいらっしゃいましたら、ご教授願いたいと思います。 よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3215-5 - 2014/07/14 (月) 13:21:47 - なそり 皆様お早い回答をありがとうございます。 おお 様 少々調べてみましたが、DMSO はタンパク質の沈殿にも使用されることがあるようですね。勉強不足でお恥ずかしい限りです。 ご指摘いただきました通り、BSA入りの培地に直接溶かしてみたいと思います。 TS　様 なるほどBSAは〜1%でも溶けるはずなのですね。 また、BSA は FFAフリーの培養グレードの物を使用しています。 ひとまず1% BSAの培地に直接ステアリン酸を溶かしてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.3215-4 - 2014/07/14 (月) 12:29:58 - TS 脂肪酸の培地への添加は、ずいぶん昔にやって、詳細を明確には覚えてないのですが、覚えている範囲で。 おおさんのご指摘のように少し組成が過激すぎと思います。 最終濃度の100µMなら、〜１％以内のBSAに十分乗ってくれると思います。 BSAはFAフリーを使っていますよね。

(無題) 削除/引用 No.3215-3 - 2014/07/14 (月) 12:23:36 - おお ってか直接培地に100uMになるようにじゃだめなの?

(無題) 削除/引用 No.3215-2 - 2014/07/14 (月) 12:19:47 - おお >[Re:1] なそりさんは書きました : > DMSOにてステアリン酸 100mM 溶液を作り、20% BSA（RPMI 1640/10% FBS）と1：1で混ぜてvortexすると、乳化(？)してしまいます。 > （見た目はスキムミルク水溶液そっくりです。） > くわしくはないんだが、50%DMSOとかBSAとか蛋白が沈殿してもおかしくないように思えるけど。。。

ステアリン酸の培養液への添加 削除/引用 No.3215-1 - 2014/07/14 (月) 12:05:35 - なそり はじめまして、こんにちは。 浮遊細胞の培養液にステアリン酸を溶かしたものを添加したいのですが、なかなかうまくいかず、過去のトピックで出ている他の脂肪酸に関する質問等を参考にしてみても成功していないので新たに質問させていただきました。 DMSOにてステアリン酸 100mM 溶液を作り、20% BSA（RPMI 1640/10% FBS）と1：1で混ぜてvortexすると、乳化(？)してしまいます。 （見た目はスキムミルク水溶液そっくりです。） ステアリン酸は当初 EtOH に溶かそうとしていましたが、100%,50% 共に溶けなかった為、DMSO にしました。 また、ステアリン酸はfinal 100μM でやりたいと思っています。 こういった方面に詳しい方がいらっしゃいましたら、ご教授いただけないでしょうか？ よろしくお願い致します。

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