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(無題) 削除/引用 No.3213-8 - 2014/07/16 (水) 13:00:35 - mbb 分光光度計のキャリブレーションがずれてる という可能性はないのでしょうか？ タンパクの場合はわかりませんが、スペクトルが レッドシフトすることはそれほど珍しくないので 立体構造による影響ということも在り得るかも しれません

(無題) 削除/引用 No.3213-7 - 2014/07/15 (火) 16:05:08 - おお 不明さんのお示しになっている蛋白はFADを含んでいますので、260nmぐらいのFADのピークなどにちょっと引っ張られてるかもしれませんね。詳しくはFADのExtinction coefficientなどしらべないとどの程度影響があるかわからないですけど。

(無題) 削除/引用 No.3213-6 - 2014/07/14 (月) 17:55:31 - 不明 理由は分かりませんが dasさんが書かれているように270 nm付近にピークが来るサンプルもあるようです 270 nm: Purification and Partial Characterization of Catalase from Chicken Erythrocytes and the Effect of Various Inhibitors on Enzyme Activity 272 nm: www.jbc.org/content/273/33/21015.full

(無題) 削除/引用 No.3213-5 - 2014/07/13 (日) 14:09:22 - おお >[Re:3] っwさんは書きました : > Extinction coefficientsはExPaSy ProtParamというオンラインツールを > 用いて求めました。水中での280nmとのことです。 > > Extinction coefficients are in units of M-1 cm-1, at 280 nm measured in water. おそらく280nmにピークがこようが、こなかろうが、その波長のODをつかって計算しているわけですから、280nmのOD値で蛋白の量を見積もるのが自然ではないですか? > > RNAやDNAが結合している可能性はあるのですが、過去の他のタンパクの経験からは核酸混入の程度によって260nmにピークが出たり、もしくは260-280付近が > フラット気味になったりと、 そのフラットの状態よりいくらか核酸の量が少なかったら260nmの肩に引っ張られて短波長側にシフトしませんか? > > タンパクが280nmから少しずれたピークを示す（理由、メカニズムがなんであれ）、そのようなスペクトラムを載せている、文献をご存知でしたら教えていただけると助かります。 > > pHの影響はまず探せばあるとおもいますよ。加えて疎水的であったり、水分子やほかのアミノ酸と相互作用してたりすると局所的なpHは溶液のマクロなpHとは一致しないというはなしはききます。 あとは例えば蛍光蛋白。通常のアミノ酸の構成で、蛍光に関与するアミノ酸の吸収スペクトルが、どれだけずれてますか?あんな極端なこともおこるんですよ。 まあshiftについては少し予想が困難でしょうから、280のあたいで計算しておくのが今回はいいのではないでしょうか。 コファクターは金属イオンなんかでも吸収が変わるかもしれませんが、その辺は調べないと詳しくはわかりません。 長波長側に何らかの吸収がありませんか?

(無題) 削除/引用 No.3213-4 - 2014/07/13 (日) 08:27:23 - das FADなどのヌクレオチドを含有した補酵素などを有していないでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3213-3 - 2014/07/13 (日) 06:45:24 - っw Extinction coefficientsはExPaSy ProtParamというオンラインツールを 用いて求めました。水中での280nmとのことです。 Extinction coefficients are in units of M-1 cm-1, at 280 nm measured in water. ＞溶かしている液などの環境とか、蛋白の構造とかなどの影響の方が大きいのでは。フェニルアラニンが260nm付近にありますね。あとRNAやDNAが結合しているとかの可能性はありませんでしょうか。 溶かしているバッファーは一般的なもの（他のタンパクでは綺麗に280nmのピークが見られる）です。タンパクの構造の影響があるのでしょうかね。 RNAやDNAが結合している可能性はあるのですが、過去の他のタンパクの経験からは核酸混入の程度によって260nmにピークが出たり、もしくは260-280付近が フラット気味になったりと、つまり単純に核酸のスペクトルとタンパクのスペクトルを重ねて足し合わせたら得られるようなことになることはありました。 が、270nmにピークを示すのは今回のタンパクがはじめてです。 タンパクが280nmから少しずれたピークを示す（理由、メカニズムがなんであれ）、そのようなスペクトラムを載せている、文献をご存知でしたら教えていただけると助かります。

(無題) 削除/引用 No.3213-2 - 2014/07/12 (土) 10:37:02 - おお >[Re:1] っwさんは書きました : > 一般的にタンパクは280nmにピーク、核酸は260nmにピークなので、 > なぜこの精製タンパクが270nmのピークを持つんだろうかと不思議に思っています。どなたか理由の分かるかたはいるでしょうか？ > > 約1000アミノ酸残基で、そのうちTrpは1%, Tyrは4%です。 > Glyが非常に多くて23%にもなるのですが、これがピークが270nmにシフトする > 原因なんてことはあり得るでしょうか？ それよりも、溶かしている液などの環境とか、蛋白の構造とかなどの影響の方が大きいのでは。 フェニルアラニンが260nm付近にありますね。あとRNAやDNAが結合しているとかの可能性はありませんでしょうか。 > > また、Extinction coefficientsと紫外吸光度からタンパク質の > 濃度を決定したいのですが、280nmでの値を用いればいいのでしょうか？ > それともピークの270nmの値を用いるべきでしょうか？ それはExtinction coefficientがどの様にして得られたのかによると思う。

精製タンパク質のUVスペクトラム 削除/引用 No.3213-1 - 2014/07/12 (土) 09:22:35 - っw とあるタンパク質を大腸菌からリコンビナントで発現させて精製しました。 精製したタンパク質はSDS-PAGEで単一バンドになる精製純度です。 その紫外線吸光スペクトラムを測定したところ、ピークが270nmあたりに 出ました。 一般的にタンパクは280nmにピーク、核酸は260nmにピークなので、 なぜこの精製タンパクが270nmのピークを持つんだろうかと不思議に思っています。どなたか理由の分かるかたはいるでしょうか？ 約1000アミノ酸残基で、そのうちTrpは1%, Tyrは4%です。 Glyが非常に多くて23%にもなるのですが、これがピークが270nmにシフトする 原因なんてことはあり得るでしょうか？ また、Extinction coefficientsと紫外吸光度からタンパク質の 濃度を決定したいのですが、280nmでの値を用いればいいのでしょうか？ それともピークの270nmの値を用いるべきでしょうか？

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