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Renilla が発現しているのにFire-fly がほとんど機能していない トピック削除
No.3208-TOPIC - 2014/07/10 (木) 09:02:19 - moaol
いつも大変お世話になっております。
初級者ゆえに言葉足らずの質問になりましたらお詫び致します。

Genecopoeia 社より、firefly とRenilla のluciferase がひとつのプラスミド内に組み込まれているa firefly/Renilla Duo-Luciferase reporter vector なるものが市販されています。Fire-fly lucifirase の下流には、任意の遺伝子の3'UTR配列があります。このベクターを使うことで、マイクロRNAが標的遺伝子の発現を抑制するかどうかを評価することができます。

現在、このベクターを購入し、形質転換して抽出したものを実験に用いています（エンドトキシンは除去しています）。私の経験としては、このベクター（9Kb）と任意のマイクロRNAを、lipofectamine2000 を使ってNIT3T3 株にco-transfection し、 マイクロRNAの抑制効果を確かめたことがあります。このとき、fire-fly、Renilla の発光値は共に4−5桁でした。

★困っている点：Fire-fly の発光値が著しく低い

現在、別の遺伝子の3'UTR配列を組み入れたベクター（10Kb）を購入し、同様の手法で実験しております。ところが、fire-fly の発光値が著しく低くなりました。発光値が高くなるであろうコントロールでも3桁です。低いものだと2桁であり100に満たない状況です。なお、Renilla の値は3−4桁の値でした。ベクターサイズが大きくなると導入効率が下がるのは理解しております。

★質問の内容：Fire-fly の発光値が低い原因

なぜ、Fire-fly の発光値が、コントロールを含めた系全体で低いのでしょうか？恥ずかしながら自分の考えていることを挙げてみました。ご覧頂ければ分かるように、知識不足ですべてモヤモヤしていますが。。。

@Fire-fly 配列周辺になにか異常がある。

Aベクターの構造が不完全（？）
Renilla は機能するがFire-fly が働かないようなベクターを、形質転換を経て、拾ってしまった可能性。なお電気泳動すると、おおむね9.5Kb のバンドが見られます。

B導入した細胞に内在しているマイクロRNAが、Fire-fly 発現を抑制している。

まとめますと、Renilla が発現しているのにFire-fly がほとんど機能していない、という状況に困っています。

何か確認すべき点、考えられる原因はありませんでしょうか？何卒ご教授頂けますと幸いです。どうか宜しくお願い致します。

敬具
　
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御礼 解決済み 削除/引用
No.3208-4 - 2014/07/10 (木) 19:39:05 - moaol
★おお 先生

早速に様々な角度からご意見を下さり、ありがとうございました。目的の遺伝子は３T３で発現しております。一方、miRNAの発現レベルは未確認です。高発現しているという可能性も念頭において、改善を試みたいと思います。

★ メールを下さった先生（1名）

本来ならばメールにてお礼を申し上げたいのですが、事情により掲示板経由での謝辞になりますこと、どうか非礼をお許し下さい。先生からのご指摘を真摯に受け止め、早速に行動に移しております。本当にありがとうございます。

おお先生、メールを下さった先生をはじめ、こちらの掲示板にはいつも助けられております。
悩みに悩んだ末に、先生方の的確かつ温かいご指導により、事態が改善することも多いです。
いつか私もどなたかの助けになれるよう、頑張ります。
本当にありがとうございました。

未解決ではございますが、おかげさまで次の一手が定まりましたので、まずは解決済みとさせて頂きます。

敬具

(無題) 削除/引用
No.3208-3 - 2014/07/10 (木) 10:54:28 - おお
あとそのmiRNAが3T3でどの程度発現しているのか。高発現しているなら、KDしてみるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用
No.3208-2 - 2014/07/10 (木) 10:51:46 - おお
その使っている3'UTR配列を持つ遺伝子は3T3で発現してますか。細胞間での発現比較をしているものなどから、比較的よく発現しているものを選ぶ手はあると思いますが。

Renilla が発現しているのにFire-fly がほとんど機能していない 削除/引用
No.3208-1 - 2014/07/10 (木) 09:02:19 - moaol
いつも大変お世話になっております。
初級者ゆえに言葉足らずの質問になりましたらお詫び致します。

Genecopoeia 社より、firefly とRenilla のluciferase がひとつのプラスミド内に組み込まれているa firefly/Renilla Duo-Luciferase reporter vector なるものが市販されています。Fire-fly lucifirase の下流には、任意の遺伝子の3'UTR配列があります。このベクターを使うことで、マイクロRNAが標的遺伝子の発現を抑制するかどうかを評価することができます。

現在、このベクターを購入し、形質転換して抽出したものを実験に用いています（エンドトキシンは除去しています）。私の経験としては、このベクター（9Kb）と任意のマイクロRNAを、lipofectamine2000 を使ってNIT3T3 株にco-transfection し、 マイクロRNAの抑制効果を確かめたことがあります。このとき、fire-fly、Renilla の発光値は共に4−5桁でした。

★困っている点：Fire-fly の発光値が著しく低い

現在、別の遺伝子の3'UTR配列を組み入れたベクター（10Kb）を購入し、同様の手法で実験しております。ところが、fire-fly の発光値が著しく低くなりました。発光値が高くなるであろうコントロールでも3桁です。低いものだと2桁であり100に満たない状況です。なお、Renilla の値は3−4桁の値でした。ベクターサイズが大きくなると導入効率が下がるのは理解しております。

★質問の内容：Fire-fly の発光値が低い原因

なぜ、Fire-fly の発光値が、コントロールを含めた系全体で低いのでしょうか？恥ずかしながら自分の考えていることを挙げてみました。ご覧頂ければ分かるように、知識不足ですべてモヤモヤしていますが。。。

@Fire-fly 配列周辺になにか異常がある。

Aベクターの構造が不完全（？）
Renilla は機能するがFire-fly が働かないようなベクターを、形質転換を経て、拾ってしまった可能性。なお電気泳動すると、おおむね9.5Kb のバンドが見られます。

B導入した細胞に内在しているマイクロRNAが、Fire-fly 発現を抑制している。

まとめますと、Renilla が発現しているのにFire-fly がほとんど機能していない、という状況に困っています。

何か確認すべき点、考えられる原因はありませんでしょうか？何卒ご教授頂けますと幸いです。どうか宜しくお願い致します。

敬具
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