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(無題) 削除/引用 No.3201-6 - 2014/07/08 (火) 23:29:31 - ぺーぺー 質問です １）-80Cから取り出して、ホモジナイズするまでの時間は各サンプル間で大体同じですか？例えば、40検体を全部室温下に置いた上でホモジナイズを開始するとかではないか。 ２）そもそも、収量の少ないサンプルは処理の最初の方とか後の方とかに偏っているのか？ ３）実験的にクオリティーがある程度確保されたサンプルのみを次の解析に使用するという解決策は取れないのか？

(無題) 削除/引用 No.3201-5 - 2014/07/08 (火) 19:14:03 - 独り言 少なくとも私は、マウスから組織を取ったら、すぐにTrizolいれています。RNAseを不活性かする目的で。そのキットではRLTがそれにあたるのですかね。 組織だけだと、-80度でも心配なので。

(無題) 削除/引用 No.3201-4 - 2014/07/08 (火) 15:47:21 - おお じゃあ逆に収量がわるい場合は必ず比が悪いですか? 肝臓なんでcarbohydratesがかなり含まれていると思いますが、それが230nmで吸収を持っているようです。trizolなどつかうと顕著に混じってくるのですがカラムではどの程度邪魔になるか経験がないので、経験のある方のコメントがつけばいいのですが、、、 溶解用のバッファーは強い変性剤がはいってますから、組織が完全に解けていれば1時間ぐらいはまず大丈夫だと思いますが、組織が多すぎたりすると問題があるかもしれません。よほど時間が気になるなら溶解したら即凍結しておいて、全部そろった時点で精製を開始するとか。 ちょっと問題が絞りきれないのでRNAがインタクトかどうか確認できないでしょうか。溶解液に組織を十分分散できなかったから収量がが悪いのかとか、もともとの組織が痛んでるとか、精製過程で何かおきたとか、、、いろいろ考えられるので。 http://www.bio.davidson.edu/projects/gcat/protocols/NanoDrop_tip.pdf

(無題) 削除/引用 No.3201-3 - 2014/07/08 (火) 15:19:33 - 臨床系大学院1年生（初心者） おお様 御回答有難う御座います。 260/230が低い場合は収量が悪いこともありますが、十分高い収量のことも多いです。 サンプルは凍結したままメスで切って急いでBuffer RLTに入れてhomogenizeしています（液体窒素に入れたチューブからサンプルを取り出してからhomogenizeを開始するまで1分前後だと思います）。 30〜40検体をやっているので、homogenizeしてから次のステップに進むまでに始めのほうの検体では1時間以上かかっているのですが、この時間が長すぎるのでしょうか。それとも、溶解用バッファー中でhomogenizeした後はある程度時間をかけても大丈夫なのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3201-2 - 2014/07/08 (火) 15:03:56 - おお 凍結したさんぷるを融解してからきってるんですかね。。。それだとRNAが分解しませんかね、、、ちょっと与えられた情報だけだったら何が起こってるかわかりませんけど。。。比が悪いやつは必ず収量が低いですか? 凍結したままポリトロンに溶解用のバッファーとともにほりこんで即座にhomogenizeするとか。 あるいは凍結切片をcryostatでつくり、それを即座にバッファーに入れてけんだくするとか。。。

RNA抽出が不安定で困っています 削除/引用 No.3201-1 - 2014/07/08 (火) 14:43:16 - 臨床系大学院1年生（初心者） 　マウスの肝臓からRNAを抽出しているのですが不安定で、時々収量が極端に少なかったり、260/230値が低かったりします。 　Qiagen社のRNeasy Mini Kitを使用し、プロトコール通りに行っています。 　組織サンプルは-80℃に保存していたマウスの肝臓をスピッツメスで約2×2×2mm大の大きさに切って用いています。（一度に30〜40検体ほど同時にやっています） 　 　同時に行ったときでも収量が1000μg/mL以上とれるサンプルもあれば、40-50μg/mL程度しかとれないときがあります（10検体に1検体くらいの割合です）。 　使用している検体の量が同程度なのに何故これほど大きな差が出るのでしょうか。 　また260/230値が多くの場合は2.0以上あるのですが時々1.0を切ってしまうことがあります（これも10検体に1検体くらいの割合です）。 　260/230値が低くならないようにするコツがあれば教えて頂けると嬉しいです。またこの値が低いことはRTやリアルタイムPCRに何か影響を及ぼすのでしょうか。

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