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(無題) 削除/引用 No.3186-5 - 2014/07/05 (土) 05:00:21 - L お示しの論文では、一過性のvillin-CreERT活性化により、２ヶ月に渡りrecombinationが維持できているので、villin-CreERTは腸上皮幹細胞で発現していると考えて良いのではないでしょうか？　例えば造血幹細胞では、16週以上造血再構築する事を持って幹細胞と定義しますが、turnoverが早い腸上皮の場合はもう少し短くても良いような気がします。ただし、小腸で80%、大腸で40%のcryptでしかrecombinationが維持されない（Rosa b-galの場合）ので、幹細胞での組み換え効率は、他の腸上皮細胞（ほぼ100%）よりは悪いと考えられます。 我々が用いているfloxマウスでは、誘導半年後でもrecombined alleleが確認できたので、villin-CreERTは腸上皮幹細胞で発現していると考えています。長期観察後のアッセイにもよりますが、40%程度のノックアウトでOKなら追加投与はいらないかもしれませんね。 ほぼ100%近いノックアウトを数ヶ月に渡って維持したい場合は、繰り返しTamoxifenを追加投与する手もあるかと思いますが、私はやった事がありません。特に、ノックアウトが腸上皮幹細胞にdisadvantageである事が予測される場合には、組み替え効率がかなり高くても、ノックアウトを逃れた幹細胞によって最終的には入れ替わってしまうと思われ、長期的にノックアウトを維持するには、繰り返しTamoxifenを投与するしかないかもしれませんね。ただ、繰り返し誘導するくらいならconstitutiveのvillin-Creを使えば良いような気もしますが。

(無題) 削除/引用 No.3186-4 - 2014/07/04 (金) 12:59:32 - なかむ TK-1さん、Lさん、コメントいただきありがとうございます。 4OHTではなくtamoxifenにより誘導可能なのですね。貴重な情報をありがとうございます。 追加で質問させていただきたいのですが、腸管上皮はturn overが早くtamoxifen投与後数週間ではknock outできている部分が減少している文献を見ました（Genesis. 2004 Jul;39(3):186-93.）。私の予定している実験では、knock outして数か月経過を見ていきたいのですが、皆様は投与後どれくらいでsacrificeされていますか？長期的に見ていく場合に、例えば初回投与1か月後などに追加投与をされた方はいらっしゃるでしょうか？ >>TK-1さん 経口投与の場合も、sunflower oilに溶解して胃に注入とされたのでしょうか？また、投与量はIPの場合と比較してどのように調節されましたか？実際に複数の投与量で試していくつもりでおりますが、もしよろしければお教えいただけますと幸いです。 質問ばかり大変恐れ入ります。 皆さまのご意見をいただければと思います。

(無題) 削除/引用 No.3186-3 - 2014/07/04 (金) 05:40:59 - L Villin-CreERTマウスを使ってますが、4OHTではなくTamoxifenを用いています。投与方法、量は同じ（1mg/dayで５日連続腹腔内投与）ですが、エタノールではなく直接オイルに溶解しています。投与数日で死亡したマウスがコントロール（floxなし）で１匹見られましたが、原因不明でした。私たちのfloxマウスでは、このプロトコールで腸上皮細胞での組替え効率が80-90%くらいです。もう少し減らしても良いかなとも思ってますが、、、

(無題) 削除/引用 No.3186-2 - 2014/07/04 (金) 01:23:49 - TK-1 > �@4-hydroxytamoxifenではなく、tamoxifenでは効果が得られないでしょうか？ > 　※tamoxifenの方がかなり安価のため、代用できればと思っています。 in vitroなら4-OHTが必要ですが、in vivo投与ならtamoxifenでかまいません。肝臓で代謝されて活性化されます。 > �Asunflower oilでの希釈は、PBSや他の溶液で代用できるものでしょうか？ 水溶性ではないのでPBSでは無理です。corn oilやsunflower oilなどの植物系のオイルが一般的に利用されています。 > �B上記投与数日で死亡してしまった書き込みもありましたが、投与時の注意点等はあるでしょうか？ 投与量は体重で補正するなり、実際に異なる量でテストして確実にdeletionがおこることを確認する必要があります。経口投与の方が個人的には好きです。

tamoxifen(Tm)誘導CreマウスでのTm投与法について 削除/引用 No.3186-1 - 2014/07/03 (木) 18:47:54 - なかむ 　いつもこちらを参考に勉強させていただいております。 　tamoxifen誘導Creマウス（Villin-Cre-ERT2）へのtamoxifen投与法について質問させていただきます。 　上記Creマウスと目的遺伝子のFloxマウスを交配し、そのF1マウスにタモキシフェンを投与して腸管特異的なknock outマウスを作成しようとしています。文献を見ておりますと、誘導のためのtamoxifen調整法として ・試薬：4-hydroxytamoxifen ・希釈法：エタノールで10mg/100μlに溶解し、さらにsunflower oilで10倍希釈 ・投与法：1mg相当を5日連続腹腔内投与 となっていることが多いのですが、 �@4-hydroxytamoxifenではなく、tamoxifenでは効果が得られないでしょうか？ 　※tamoxifenの方がかなり安価のため、代用できればと思っています。 �Asunflower oilでの希釈は、PBSや他の溶液で代用できるものでしょうか？ �B上記投与数日で死亡してしまった書き込みもありましたが、投与時の注意点等はあるでしょうか？ 以上の点につきまして、御存知の方がいらっしゃいましたらば、ご教授いただけますと幸いです。

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