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(無題) 削除/引用 No.3181-19 - 2014/07/09 (水) 19:43:44 - sora おお様 お疲れ様です。 返信遅れてしまい、申し訳ありません。 科学的には問題あるとは私自身思いません。おお様の仰る通りまさに「保守的発想」なんだと思います。 まずはどの程度controlでNDなどの表記により記載されている論文があるかを確認してみます。 有難うございます！ 確認したうえで、再度トピックをあげるかもしれません。 宜しくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3181-18 - 2014/07/06 (日) 05:25:24 - おお >[Re:17] soraさんは書きました : > おお様、mom-a様 > まさにその通りです。あくまで、「以上」or「≧」でしか表記できないことになりますよね。 > 勉強不足で申し訳ないのですが、そういった記載をしている論文を拝見したことがなく、通常そういった表記方法があるのか、通用するのか判断が付きません。 > > 7744様 > 絶対定量、controlがNDの表記方法も通常あるのでしょうか。確かにABのページなどを見ますと絶対定量・コピー数で測定とも記載されているのですが、実際の投稿論文や学会などで拝見したことがありません。 > > > ご教授いただければと思います。 科学的にどこに落ち度があるとお考えでしょうか。落ち度があるとすれば私のアドバイスがあまりよくなかったとおもえます。どうかご指摘ください。 保守的なアプローチでいくかどうかは各研究者の判断ですから、たしかにこれでいいとつっぱねるつもりはありません。文献はNDで書いているものはあまり見かけませんが、一つは検出限界を確認してないからどの程度差があるかわからないからかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3181-17 - 2014/07/04 (金) 19:38:17 - sora おお様、mom-a様 まさにその通りです。あくまで、「以上」or「≧」でしか表記できないことになりますよね。 勉強不足で申し訳ないのですが、そういった記載をしている論文を拝見したことがなく、通常そういった表記方法があるのか、通用するのか判断が付きません。 7744様 絶対定量、controlがNDの表記方法も通常あるのでしょうか。確かにABのページなどを見ますと絶対定量・コピー数で測定とも記載されているのですが、実際の投稿論文や学会などで拝見したことがありません。 ご教授いただければと思います。

(無題) 削除/引用 No.3181-16 - 2014/07/04 (金) 17:12:45 - mom-a >誘導後にどれだけ発現が増加したかをみたいのです controlが35cycleでundetectedであればCt値≧0なので（＞40かな？） 薬物処理した場合のCt値が20だったとき�僂t≧20 この要領で計算すれば差は○倍以上、というのが計算できますよ、ということになります。 なので、何cycle回したかによって計算結果が違ってきます。 >任意の点における限界値との比較という捉え方で合ってますでしょうか？ おっしゃることが上記のような意味でしたら、そうです。 30cycleで止めるか40cycle回すかでの数値は違ってきますが、あくまでも≧であるということですね。 検出限界（何cycle回したか）は表示しておく必要があると思います。

(無題) 削除/引用 No.3181-15 - 2014/07/04 (金) 10:12:02 - 7744 絶対定量なら、コントロールが検出できなくても問題ないですね。 コピー数で出せるので。 コントロールはグラフ上でも「ND」でいいですし。

(無題) 削除/引用 No.3181-14 - 2014/07/03 (木) 22:47:51 - おお >[Re:13] soraさんは書きました : > その場合あくまで、任意の点における限界値との比較という捉え方で合ってますでしょうか？ その表現よくわからないのですが、、、 要するに4倍しても検出できて8倍で検出できなくなったなら、コントロールは検出できないわけだからサンプルの1/4未満の量しかないので、差は4倍以上(じっさいは4は含まれないから厳密な表現じゃないですけど)と表現できるということです。

(無題) 削除/引用 No.3181-13 - 2014/07/03 (木) 18:15:37 - sora おお様：有難うございます！確かに検出限界を求めて、その検出限界とSAMPLEを比較して増加をみるのも手ですね。お恥ずかしながらその発想はなかったです。その場合あくまで、任意の点における限界値との比較という捉え方で合ってますでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3181-12 - 2014/07/03 (木) 15:22:38 - おお 検出限界がわかれば、それ以下だということがいえるので、5倍以上の増加とか具体的にいえますよね。炎症を起こしたサンプルを希釈していきどこで検出限界に達するかみてみると、そう言う数字はでてくるのでは?

(無題) 削除/引用 No.3181-11 - 2014/07/03 (木) 15:20:33 - sora 7744様：その通りです！誘導後にどれだけ発現が増加したかをみたいのです。 おお様：プライマーの件ですが、ABのタックマンで発売されているものの中で推奨されているものを購入して使っています。確かにおお様の仰る通り、他の報告なども再度あさってみる必要がありますね。ただ、新しいプライマーの購入は最終手段だとも思っていまして・・・金銭的にも 皆様、本当にありがとうございます！ 早速頂いたアドバイスでいくつか検討してみますね！

(無題) 削除/引用 No.3181-10 - 2014/07/03 (木) 15:09:33 - sora N様：希釈倍率ですね。今は20倍希釈で行っています。希釈倍率も次回の検討項目に入れたいと思います！ 7744様：タックマンを用いています。sampleにおいてはきれいなメルティングカーブが描けています。kitの説明書をもう1度見直し、上限、限界をみてみます！ おお様：sampleの発現量がcontrolと比較してどれだけ増加しているか相対的に判断している限り、検出限界以下だと比較できないのでは、と思っていたのですが、いかがでしょうか

(無題) 削除/引用 No.3181-9 - 2014/07/03 (木) 14:53:48 - sora 早速のお返事有難うございます！ alpha様：はじめて検討するプライマーになります。TNFaなのですが、今後も他の炎症に関連する因子を検討したいと考えており、IL類もターゲットにできるかどうかの始めの検討になります。 おお様：testとは添加処理した物質のことですよね??　はい、検出できています。濃度をふって、濃度依存的に増加している傾向があります。あくまで検出値での比較になりますが。internal controlはGAPDHを用いており、検出できています。

(無題) 削除/引用 No.3181-8 - 2014/07/03 (木) 14:33:34 - おお 数字として処理するのは確かにこのままじゃ難しいですね。何か統計的な手法があればいいのでしょうけど(差があるということだけでも)、思いつきません。 プライまーをかえるなどということに関しては、かえると検出できる可能性はあるかもしれません。またRTもスペシフィックなプライまーを使ったり(オリゴdTにまぜるとか、ちょくせつスペシフィックプライまーだけでRTするとかいろいろ方法論はありますが)で改善する可能性はあります。 いちど、正常な状態でその遺伝子が発現している報告があるかどうかなど、調べてみてはどうでしょうか。それによってプライまーをかえるのかとかターゲットをかえるのかとか判断しやすくなるかもしれません。あるいは違うよさそうなプライマー配列を見つけることができるかもしれませんよ。

(無題) 削除/引用 No.3181-7 - 2014/07/03 (木) 14:10:00 - 7744 炎症を誘導していない状態で発現が低いということのみ言いたいのであればそれで問題無いと思うのですが、察するに、おそらく誘導前と比べて誘導後に何倍になったかという具体的な数値が出したいのではないでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3181-6 - 2014/07/03 (木) 13:05:47 - おお よくわからないのですが、ターゲットを帰るということは、検出限界以下というのは不都合なんでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3181-5 - 2014/07/03 (木) 12:56:32 - 7744 まずインターナルコントロールがちゃんと出ているならqPCR自体はうまくいっていると考えていいですよね。 次に、qPCRのシステムはサイバーでしょうか？あるいはタックマンですか？ サイバーだと仮定して書き込みますが、もし炎症を誘導したサンプルにおいてちゃんと増幅が見られ、なおかつメルティングカーブがきれいに出ている場合はプライマーも問題ないでしょう。 そうなると考えられるのは、やはりコントロールサンプルにおいては、目的遺伝子の発現が検出限界以下であると考えられるでしょう。 ということは次にやれることは、Nさんも書き込まれていますが、qPCRの反応に用いるcDNA量を限度いっぱいまで使用することではないでしょうか？ �@、方法としてはRTに使用するRNA量を限度いっぱいまで増やす。 �A、qPCRに用いるcDNA量を、qPCRの反応を阻害しない上限まで増やす。 この二点かと思います。 ともにキットのマニュアルに上限は記載されていると思いますので、それを参考にされるといいと思います。 それでも検出できない場合は、自分なら諦めて違うターゲットを探します。

(無題) 削除/引用 No.3181-4 - 2014/07/03 (木) 12:04:28 - N 同じく炎症因子を見ていた際に刺激前での発現量がdetect出来ないという現象に出会ったことがありますが、その際、500ngのRNAを鋳型に合成したcDNAを１００倍希釈して用いていましたところを、５倍希釈など希釈倍率を下げることでdetectできたという経験はあります。

(無題) 削除/引用 No.3181-3 - 2014/07/03 (木) 11:21:25 - おお controlでなくてtestの方は検出できてるんでしょうか? それなら検出限界以下から、検出できる量に発現が上がったということでいいのではないでしょうか。 internal controlはちゃんとはかれてますでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.3181-2 - 2014/07/03 (木) 11:12:32 - alpha これまでに検討されてきたターゲットでしょうか？ 何かにもよりますが、ないものはないですからね。 もう少し情報がないと何とも言えませんが、私ならその遺伝子をターゲットにしません。 コントロールで発現しないわけですから。

realtimeRTPCR 増幅しない 削除/引用 No.3181-1 - 2014/07/03 (木) 10:21:11 - sora いつもお世話になっております。 realtimeRTPCRで炎症因子の発現誘導を見ています。 しかし、controlのCt値がUndetとなり、検出できません。 Cycle数を35から段階を経て現在45cycleまで増やしてみましたが、やはり検出されず・・・ プライマーを設計しなおしてみるのが良いでしょうか？ 炎症が生じていない条件としてのcontrolだから発現誘導されなくて当たり前なのでしょうか？ 皆様のなかで同様の経験をされた方、コツなどご存じの方がいらっしゃれば、ご教授いただければと思います。

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