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(無題) 削除/引用 No.3180-8 - 2014/07/09 (水) 00:38:15 - おお 中年さん、さいどかいとうありがとうございました。同じような経験をされている方がいるのがわかりました。

(無題) 削除/引用 No.3180-7 - 2014/07/08 (火) 19:12:55 - 中年 数年来ECL Plusを使っているので、ご指摘の問題に気がついたときもそれだったと思います。暗室で光ってるのが肉眼ではっきり見えたのでちょっと不味かったかなと思ったら、そういう具合だった記憶があります。

(無題) 削除/引用 No.3180-6 - 2014/07/08 (火) 03:01:19 - おお ありがとうございました。中年さんのお使いのdetection kitはなんでしょうか。 私の経験ではたしかECLplusでそう言う感じだったです。ミリポアのすべてのものが1つの溶液にすでに混ぜられているやつは、すごいシグナルがでたので、りプローブしてクラッシックなECLでけんしゅつしたところ大丈夫っぽかったり。。。さいきんあれやこれやとっかえひっかえでちょっと混乱はしてますが。ミリポアのもうひとつのやつは同じ場所の違う蛋白をみようとして見れなかったことがあります(というのは私自身がてをうごかした経験ではないですが)。

(無題) 削除/引用 No.3180-5 - 2014/07/04 (金) 21:11:26 - 中年 私も強く発光させた個所は２度目のウエスタンで抗原性が落ちることがあるという印象があります。バンドの中央が抜けたようなパターンを経験したこともあります。ECLの反応で生成するラジカルが抗原を攻撃してしまうからかな、とこれはあまり根拠もなく考えていました。色がつくのはチロシンか何かが褐変するのかな？

(無題) 削除/引用 No.3180-4 - 2014/07/04 (金) 12:50:46 - おお >[Re:3] AAさんは書きました : > 知人のラボの教授は、 > リプローブしたメンブレンでは定量性が担保されない、 > という信念の持ち主でした。 > > 実際に試した上での意見か、感覚的なものなのかは不明ですが。 ありがとうございました。私も感覚的なのですがそんなきがしたので質問させていただきました。 >[Re:2] 中西部ポスドクさんは書きました : > 我々はECL selectを使っていますが、明らかにPVDF膜が茶色になりますね。普通のECLの時には見られませんでした。 > 自分の感触ではECLと反応するとその後HRPの活性はかなり落ちるように思いますので、次の日に異なる種の抗体で(例えば1日目ラビット、2日目マウス)検出するとほとんど前のバンドは出て来ないことが多いです。黄色くなった部位が特にもう一度出にくい印象はないので、大丈夫だと思います。同様のサイズを検出しても特に問題ありませんでした。 > reprobingに関しては、上記の通り種を変えて検出している限り、stripも行いません。 ECL selectではだいじょうぶなんですね。その前のバージョンのECL plusでもきいろくなりますたしか。膜にきっちりくっついているようで、その黄色くなった産物を蛍光スキャナでも検出することができるとGEがいってました。 reprobing は同じようにやってますね。種を変える、よわいほうから先に検出するなどでなるべくstrippingをさけてます。ばあいによってはアルカリにさらすという弱い方法をとってますが。どうも酸性の方が次のシグナルが弱くなりがちのような気がするので。 >むしろstripすると定量性にむらが出る印象があります。ただしどうしても必要な場合（リン酸化とトータルといった）はFAlexa488&Cy3といった蛍光で二重染めするか、二枚同じものを流すかすると思います。 なるほど。strippingしてprobingした後ちょっと理由があってさいしょの抗体でreprobingしたことがあって、ずいぶん印象がちがうなっていることがありましたので、、、それで伺ったしだいです。stripping さけているのですね。

(無題) 削除/引用 No.3180-3 - 2014/07/04 (金) 11:13:12 - AA 知人のラボの教授は、 リプローブしたメンブレンでは定量性が担保されない、 という信念の持ち主でした。 実際に試した上での意見か、感覚的なものなのかは不明ですが。

ECL 削除/引用 No.3180-2 - 2014/07/04 (金) 04:59:28 - 中西部ポスドク 我々はECL selectを使っていますが、明らかにPVDF膜が茶色になりますね。普通のECLの時には見られませんでした。 自分の感触ではECLと反応するとその後HRPの活性はかなり落ちるように思いますので、次の日に異なる種の抗体で(例えば1日目ラビット、2日目マウス)検出するとほとんど前のバンドは出て来ないことが多いです。黄色くなった部位が特にもう一度出にくい印象はないので、大丈夫だと思います。同様のサイズを検出しても特に問題ありませんでした。 reprobingに関しては、上記の通り種を変えて検出している限り、stripも行いません。むしろstripすると定量性にむらが出る印象があります。ただしどうしても必要な場合（リン酸化とトータルといった）はFAlexa488&Cy3といった蛍光で二重染めするか、二枚同じものを流すかすると思います。

WB re-probing 削除/引用 No.3180-1 - 2014/07/03 (木) 04:44:19 - おお WB re-probingで2点おうかがいしたいことがあります。 1つはECL plusグレードあるいはそれより感度がたかいもので、強いシグナルが検出されるときその部分の膜が黄色く色が付いていることがあります。更なるreprobingをおこなった場合、感触としてその黄色くなった部分は発光しないようなきがしてます(同じプローブとか同じ場所にある違う蛋白の抗体をつかうとかしたばあい)。皆さんはその様な感触はありませんか?あるいは何かこれについて情報がありませんか? 2点目は、 reprobingを繰り返していった場合定量性はどの程度確保できるとおもわれますか?(上記のような明らかなdisturbingがないということで。ただシグナルがでたところは多少なりとも次のHRPの反応に影響与えてるかもしれませんよね)。

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