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(無題) 削除/引用 No.3178-9 - 2014/07/03 (木) 04:18:22 - おお あと、1st使わずにいきなり2ndやるとどうかな。

(無題) 削除/引用 No.3178-8 - 2014/07/03 (木) 02:52:20 - おお nestedで感度をあげているわけですよね。PCRはもともと微量のDNAを検出できるのでオリジナルのDNA溶液でバンドがなくとも、増幅して検出できるわけですよね。 でまえのコメントにも書きましたが、1stのPCRでバンドが見えるシステムなのになんで2ndをやっているのかという疑問と、 もしかしたらその答えとして1stでバンドの検出が難しい(時に検出しにくいことがあったりする)ので2ndをやっている可能性があるのではないかという可能性を考えた方がいいのではないかと。

(無題) 削除/引用 No.3178-7 - 2014/07/02 (水) 22:35:12 - 初心者 皆様ありがとうございます。 初歩的な質問ですみませんが、 1st PCRを行ったプライマー対より内側のプライマー対で2ndPCRをするとありますが、1stPCRの時点で1000のバンドしかなかったら、2000のバンドは出ないのではないのかと思ったのですが合っていますか？

(無題) 削除/引用 No.3178-6 - 2014/07/02 (水) 22:16:09 - 初心者 Harmonia さん ありがとうございます。 新 1st 新 2nd は、KOの500なら出ます。WTの2000が出ず、ヘテロも500の1本だけです。 旧 1st 新 2nd はまだ試していません。 旧1st は、wTは2500、ヘテロは1000+2500、ＫＯは1000 新1st は、WTは何も見えず。ヘテロが1000の一本のみ。KOは1000 ロットが変わってこんなに苦労することになるとは思ってもみませんでした。 BufferやTaq、DWは新しくしました。プライマーを溶解したTEが駄目になっていたとかという可能性はありますか？ 半年前ぐらいに同じTEで別のプライマーを溶解してPCRを行っていますが問題はありませんでした。

(無題) 削除/引用 No.3178-5 - 2014/07/02 (水) 22:09:39 - おお すでに指摘があるようにどのステップ、どのプライまーで問題が生じているか絞り込むようにした方がいいかと、、、1stですでに問題がおきていると見れるようですが、nestedなので、、、そのプロダクトを新、旧の2ndのプライまーで増えるのか、、、 逆に1stを旧プライまーでやって新2ndプライマーで増えるのかとか、どこまでやられたのでしょうか。。。

(無題) 削除/引用 No.3178-4 - 2014/07/02 (水) 22:00:08 - おお あれ、そもそも1stでバンドが見えてるのになんでさらにPCRしてるんでしょうか。。。

(無題) 削除/引用 No.3178-3 - 2014/07/02 (水) 21:56:52 - おお 合成しにくい配列とかあって、そう言うのは脱塩だけだと目的の配列の最終プロダクトの割合が少なかったりします(たとえばGストレッチは難しいようです)。合成委託しているところはどの様に合成したものを評価しているのでしょうか。加えて精製方法を一ランクあげてみるのもてかもしれません。それか会社をかえるか。。。購入のヒストリーがのこっていればどの様な精製度のものを以前買ったのかわかるかもしれませんね。 素朴な疑問ですが、ネストでないとかからないですか? あと問題があるとすると、溶かしたバッファーか、、、

(無題) 削除/引用 No.3178-2 - 2014/07/02 (水) 21:06:12 - Harmonia 新1st 新2nd バンドが何も出ない。 旧1st 新2nd ？ 旧1st wTは2500、ヘテロは1000+2500、ＫＯは1000 新1st ？を鋳型にすると1000 合っていますか？ その古いプライマーの溶液には、そもそもマウスのゲノムDNAが混入していた？ そうだとすると、wtもＫＯも混入していないと話がおかしい。 プライマーの精製度が、PCRの増幅効率に影響するものなのでしょうか？ （配列に間違いなければ、ロット差が出るのはそれくらいか？）

nested PCR がうまくいかない 削除/引用 No.3178-1 - 2014/07/02 (水) 19:57:21 - 初心者 いつも勉強させていただいております。 今まで上手くいっていたnested PCR がうまくいかなくなりました。 5年前から同じプライマーを使って、時々マウスのジェノタイピングを行っています。 先輩のプロトコールに従って、nested PCR で2000bpのWT、500bpのKOバンドを見ています。 2nd PCR用のプライマーがなくなったので、同じ配列でプライマーを1st 用のものも一緒に注文しました。新しく届いたプライマーで1st. 2nd. PCRを行ったところから上手くいかなくなってきました。出るはずであるWTのバンドが何度やり直しても、過去にでたことがあるサンプルでも出なくなりました。KOのバンドは出ます。 1st PCRのサンプルを電気泳動してみたら、1000bpのあたりにバンドが見えます。 新しいプライマーがダメになったかと思い、再度注文しましたが同じ結果です。 新旧のプライマーの配列に間違いがないことも確認済みです。 念のため残っていた5年前のプライマーで1st PCR後泳動してみると、wTは2500辺りに、ヘテロのものでは2本のバンド(1000、2500辺り)、KOは1000辺りにバンドが見えました。 今までの条件で上手くいっていたので、アニーリング温度等の条件はまだ変えていません。 新しいプライマーと相性がいい条件を見つければいいのかなという風にも思っているのですが、こんなことはよくあることなのでしょうか？ 気がついた点やアドバイスをいただけると有難いです。 よろしくお願いいたします。

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