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(無題) 削除/引用 No.3177-9 - 2014/07/04 (金) 17:52:43 - ~ 薬の効果を調べたいのに、前後の診断法を変えてしまったのですか… １．薬の効果による菌数の減少 ２．ProK処理を行わないことによるDNA抽出効率の低下 の片方又は両方が起きているのでしょうけれども、結論の出しようがありません。 とりあえず結論がほしいのであれば、投与前のデータはありますので、投与後について今いる魚でデータを取り直すのが近道ではないでしょうか。 その時に、今後の操作の簡略化のためにProKありなしをやってもいいのかもしれません。 ただ、それをやるのであれば、今やっている診断法ではどのような妥当性評価が行われていて、どのような評価をし直す必要があるかを確認しておく必要があるでしょう。 単に増えましたという報告しかないのでしたらいいのですが、 きちんと検出下限等が調べられている診断法でしたら、論文1報分くらいのデータを取ることになるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3177-8 - 2014/07/04 (金) 02:01:18 - おお >[Re:7] ヤマさんは書きました : > 今回はポジコン、ネガコンには問題ありませんでした。サンプルは全て陰性でしたが、ちょうど2日前にも検査をしており（その時は全てPK有で）全て陽性という結果が出ていました。その陽性結果により、その集団に対し投薬を2日間行ったあとに取ったサンプルだったのですが、薬が効いて陰性になったのか細菌DNAの抽出ができておらず陰性なったのかが分からずにこちらで質問しました。 抽出方法がちがうのだから、違う結果が出てもおかしくないので結局わからないが結論では。 楽観的に大丈夫だろうという感触はあるけど、それは科学的ではないので。 ちょっと気がかりなのは2日間できれいさっぱりなくなってしまうかなというところです。まあこれもまた、感染時のそのバクテリアの量によるでしょうけど。 次回やるとき半分に分けてPKtreatとnone-treatでやってみて何ら差がない事を見ていきながら、どの様に考えればいいかみていってもいいかもしれません。PKtreatmentがいらないとなればステップはへるでしょうから。

(無題) 削除/引用 No.3177-7 - 2014/07/03 (木) 16:07:26 - ヤマ 質問したものです。 抽出したDNAを用いてPCRを行うのですが、その際ポジコン、ネガコンは用いています。ネガコンはPCR試薬＋DW、ポジコンは以前に陽性となったサンプルのDNAを入れています。ちなみにこのポジコンはPK有の基本プロトコルで行っています。 今回はポジコン、ネガコンには問題ありませんでした。サンプルは全て陰性でしたが、ちょうど2日前にも検査をしており（その時は全てPK有で）全て陽性という結果が出ていました。その陽性結果により、その集団に対し投薬を2日間行ったあとに取ったサンプルだったのですが、薬が効いて陰性になったのか細菌DNAの抽出ができておらず陰性なったのかが分からずにこちらで質問しました。 ちなみにサンプルは魚の脾臓で、脾臓内に目的とする菌が存在すればPCRで陽性となります。

(無題) 削除/引用 No.3177-6 - 2014/07/02 (水) 22:32:34 - dad 用いたプライマーがworkすることの証明と，純菌を用いてどの位の数の菌体が存在すれば，用いたPCR条件で検出できるのかという検出限界が必要かと思いますが。

(無題) 削除/引用 No.3177-5 - 2014/07/02 (水) 21:14:41 - Harmonia 別スレのプライマーの話を読んだ後なので、勘違いしましたが、 ＞ある細菌の検出PCRにおいて結果が全て陰性になりました。 昔できてたのに、いまダメ、ということで無く、うまくいったことがない、 ということでしょうか？ うまくいったことがないなら、やはりポジコンは必要でしょう。

細菌ゲノムDNAが抽出できているかを問題にしていいのか？ 削除/引用 No.3177-4 - 2014/07/02 (水) 18:28:24 - ~ 少なくとも、同じグラム陰性菌である大腸菌については、ProK処理することなくいきなりフェノクロで振ってもある程度のゲノムDNA＋プラスミドDNAが抽出できます。 そのため、抽出効率を無視すれば、ある程度は抽出できていると思います。 ただ、行っているのは、特定の方法でDNA抽出・PCRを行い、陽性だった場合は魚が細菌に汚染されると判定する、という診断法なのでしょうか？ そうであれば、ある細菌のDNAが抽出できていたかどうかは問題ではなく、特定の方法で取ったデータがないために診断はできないという結論になると思いますが。 魚が細菌に感染している場合は、抽出効率や検出限界などの話を気にしなくてもいいくらい多くの細菌が存在する。などの前提条件があれば、話は変わってくるのかもしれません。 前提条件なしに独自に構築した診断法の妥当性の確認を行いたいのであれば、 そのようなデータを取られてはいかがでしょうか。

スライドからの回収 削除/引用 No.3177-3 - 2014/07/02 (水) 17:05:23 - ema ある疾患に感染が影響していると仮説をたてて、昔のスライドになっている検体（パラフィン固定HE染色ずみ）でカバーグラス外してパラフィンからの抽出カラムキットを使って回収し、検出したことがあります。 状況が異なりますがちゃんとPosi,Nega判定できました。 ただ非常に少なかったのでNested-PCRでした。 他の系の話ですがグラム陰性菌を溶かすのに目で見えるような変化がないのですがSonicationをかけて壊していました。ProKはいれなかったような。 長いゲノムがいるならSonicはだめですがよくある長さのPCR程度だと大丈夫でした。

(無題) 削除/引用 No.3177-2 - 2014/07/02 (水) 16:42:00 - おお 大腸菌などだと、尿素とたぶんSDSとかいれるかな、、、でけんだく、破砕して、LiClでRNAを沈殿させて回収するようなプロとコールもあるので、おそらく壊れてるだろうなとはおもいますが、 その菌が培養できるものなら、その菌freeの組織に培養したものを検出したいレンジで加えて様子を見ることもできるかと思います。その菌が培養できないなら大腸菌とかでだいたいの検討をつけるとか。 実験にもよりますけど、何か検出できるものを平行してやらないと、特に実験的感覚もないのも加えると、結局結論が出ないのではないでしょうか。理想的にはその菌をもつ(感染した)ポジティブコントロールがほしいところです。 示された実験のフィールドについては明るくないので見当違いなことをいっていたらすいません。

PK無のフェノクロ法 削除/引用 No.3177-1 - 2014/07/02 (水) 16:09:37 - ヤマ 組織からのDNA抽出法について。 現在魚病診断をしておりますが、ある細菌の検出PCRにおいて結果が全て陰性になりました。 原因として、「本当に陰性である」「PKを使わずにフェノクロ法で抽出した→目的とする細菌からのDNAが抽出できていなかった」ことが考えられました。ちなみにその細菌は、グラム陰性菌で薄い細胞壁があるものです。 DNA抽出は通常以下のプロトコールで実施しています。 ●組織をTUNESおよびProteinaseKで溶解するまで放置。 ●5MNaClを加える。 ●フェノクロ（TE飽和フェノール：クロロホルム＝1：1）を加え、転混。 ●遠心 ●上清を抜き取り、100％エタを加える。 ●析出したモヤ（DNA）を70％エタにて洗浄する。 ●70％エタを捨て、RNaseA、5MNaCl、10mMTris-HClの混合液にてモヤを溶解する。 ●フェノクロを加え、転混。 ●遠心 ●上清を抜き取り、100％エタを加える。 ●析出したモヤ（DNA）を80％エタにて洗浄する。 ●80％エタを捨て、10mMTris-HClで溶解する（抽出完了）。 今回、最初の段階のProteinaseKを使用せずに抽出を行いました。TNESUは2M-Tris(pH7.5)、5M-NaCl、0.5M-EDTA-3Na、10％SDS、Ureaの混合液です。ジルコニアボールを使用したホモジナイズにより、肉眼では綺麗に溶けているように見えました。 ProteinaseKを使用しなかった場合に細胞壁のある細菌の抽出ができているか否かをお教えください。

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