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(無題) 削除/引用 No.3170-21 - 2014/07/02 (水) 18:09:39 - 柴 qw様 なるべく表層の細胞を狙った方がよさそうですね…！ サンショウウオ様 ガラスの厚さは全く気にしておりませんでした、確認してみます。ありがとうございます。 蛍光が有ることは確かなのですが、形がよくわからないという状況です…

(無題) 削除/引用 No.3170-20 - 2014/07/01 (火) 19:07:10 - サンショウウオ 蛍光の有無だけなら蛍光顕微鏡程度の解像度で判別できそう。

(無題) 削除/引用 No.3170-19 - 2014/07/01 (火) 19:05:38 - サンショウウオ 共焦点レーザー顕微鏡って。。。たしか。。。No.1S規格の厚さ0.16〜0.19mmぐらいのガラスが最適だったような。。。 　0.1mmのガラス厚の違いでも結構レーザーの焦点変わって映りが変わる印象があります。

(無題) 削除/引用 No.3170-18 - 2014/07/01 (火) 08:18:29 - qw ＞・レーザ顕微鏡検鏡モードの対物レンズx40では、レーザーの出力を ＞最強にしても見えない ＞なお観察サンプルは生きた植物体の根です。 40倍の対物レンズだと、試料が厚すぎて、焦点距離が足りない可能性はないのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3170-17 - 2014/07/01 (火) 08:16:12 - 柴 AAさん はい、ありがとうございます！ おおさん そのあたりは全くいじったことがありませんでした、常に明視野観察になっていると思われます。

(無題) 削除/引用 No.3170-16 - 2014/07/01 (火) 00:53:13 - おお あとDICのセッティングどうなってますその顕微鏡。

(無題) 削除/引用 No.3170-15 - 2014/06/30 (月) 20:12:33 - AA >>カバーガラスの向き umumuさんのお話は、カバーガラス自体にオモテウラがあるのではなくて、 倒立顕微鏡ならサンプルが乗っている面をレンズに向ける必要がある、 という話だと思います。大丈夫だとは思いますが、念のため。。。

(無題) 削除/引用 No.3170-14 - 2014/06/30 (月) 17:04:54 - 柴 皆さま本当にありがとうございます…！ おお様 そうなのですね、退色をなめておりました…！気をつけます。 フィルターは疑ったことがありませんでしたが、私の研究室の人はGFPを見ようとして過去に全員失敗しているのでもしかすると…いろいろやってみてダメでしたらメーカーに聞いてみます。レンズの汚れにも気をつけてみます。 さりーさん 購入した種で、GFP蛍光と局在箇所は私たちの研究室でも光学顕微鏡では一応確かめてあります。 ただPIが見えるかどうかは確かに試してみた方が良さそうに思います、さっそくやってみます。 umuumuさん カバーガラスの向きは気にしたことがありませんでした…！気をつけてみます。 AAさん、mimikkuさん さりーさんのご提案のPIで、レンズのせいかどうかを確かめてみようと思います。

(無題) 削除/引用 No.3170-13 - 2014/06/30 (月) 16:38:23 - mimikku そういえばDryレンズにOilを載せてしまい、 にじんだOilがレンズの裏までいってしまいきちんと結像しなくなったことがありました。 別のサンプルでもきちんと画像が撮れるかは念のため確認したほうがいいでしょうね。 共通機器ですと誰がどんな使い方をしていたかわかりませんから・・・

(無題) 削除/引用 No.3170-12 - 2014/06/30 (月) 16:33:43 - おお フィルターはどうでしょう。適切なものをつかってますか? たまに外に表示されているフィルターと中に入っているフィルターがちがったりとか、、、 あとレンズが汚れてませんか?ゆしんでつかうオイルがたまたまレンズについていたとか、、、

(無題) 削除/引用 No.3170-11 - 2014/06/30 (月) 15:59:54 - AA >>使用機器はLSM5Pascalで、63倍で水浸、100倍で油浸と聞いていたため、 >>40倍はドライで使っておりました。水浸で改善することもあり得ますでしょうか。 ドライか水浸か油浸か、はレンズごとに決まっています。 Zeissの同じ40倍の対物でも、ドライ・水浸・油浸のものがそれぞれありますので、 必ず確認して使ってください。レンズの側面に書いてあるはずです。 間違ったレンズの使い方をするとレンズ自体をダメにします。 レンズ1個で結構値が張るので（試しにご自分で調べてみてください）、 必ず正しい使い方をするようにしましょう。 GFP以外のシグナルはくっきりとピントが合うのでしょうか？ すべてのシグナルがダメならレンズの使い方が間違っているかもしれません。 水浸→ドライの間違いならいいですが、 ドライ用のレンズ内に水やオイルが染み込んでいるとすると。。。

(無題) 削除/引用 No.3170-10 - 2014/06/30 (月) 15:21:58 - umumu イージーミスの話になりますが 前に一度、高倍率にすると何も映らなくなることがありました。 原因はカバーガラスを対物レンズの方に向けていなかったせいでしたが、 柴様と似たような現象だったので一応確認してみるといいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3170-9 - 2014/06/30 (月) 14:55:51 - さりー 植物の根っこはよく見るので経験談です。なので適当かも知れませんが。 そもそもちゃんとGFPは蛍光してますか？ WBで発現を見ろとは言いませんが、WTと較べて明らかに蛍光してましたか？ トランスフォーマんつは数十ラインあると思いますので、一ラインでも強い蛍光を発するものがなければ、 ・そもそも形質転換がダメか ・コンストラクトがダメか ・発現しても遺伝子にとって居心地が悪いので分解される のどれかだと思います。 あと、Localizeはどこでしょうか。 膜ならFM、細胞壁ならPI、核ならDAPIが使えます。簡単なのでco-Localizeするかどうか見てみましょう。 蛍光がぼんやりでも綺麗にマージされていれば説得力はある程度あります。

(無題) 削除/引用 No.3170-8 - 2014/06/30 (月) 14:46:28 - おお GFPはすぐに減衰しますよ動物組織、細胞での経験では。EGFPはけっこう丈夫に思います。 >それらからの蛍光が漏れてくる？ もれてきますかね、、、きょう焦点の仕組みを考えれば、、、反射の効率のいい散乱が起こってたら別かもしれませんけど。

(無題) 削除/引用 No.3170-7 - 2014/06/30 (月) 14:17:03 - 柴 midori様 参考ページへのリンクありがとうございます、とても勉強になります！ それから先ほどの私の投稿の最後、問題はピントではなくて見ようとしていない層がレーザー光を吸ってしまうことやそれらからの蛍光が漏れてくる？ことですね、おそらく…！

(無題) 削除/引用 No.3170-6 - 2014/06/30 (月) 14:01:39 - 柴 mimikku様、おお様、midori様 ご回答ありがとうございます。 使っている顕微鏡は専攻の共通機器なのですが、他の研究室は自前で持っているため実質的に私の研究室のみで使っており、かつ誰も使用法に明るくないという状態でこちらに頼ってまいりました…。同じ型を使っている研究室があるかどうか聞いてみます。綺麗なサンプルをもらうというのも試みてみたいと思います。 使用機器はLSM5Pascalで、63倍で水浸、100倍で油浸と聞いていたため、40倍はドライで使っておりました。水浸で改善することもあり得ますでしょうか。 GFPにブリーチングに強いイメージを持っていて、あまり気にしたことがありませんでした。40倍でしばらく試みた後20倍に戻しても一応蛍光が見えていたので大丈夫なのかなと思ったのですが…。 複数回の走査は試みましたが、あまり改善されませんでした。 なお観察サンプルは生きた植物体の根です。蛍光色素を使用した際にはそれで問題なかったので今回も丸のまま観察しておりましたが、ピントを合わせづらくなっているかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3170-5 - 2014/06/30 (月) 13:16:15 - midori 同じ顕微鏡をよく使っている方からのアドバイス、に賛成です。 ついでに綺麗なサンプルも貸してもらってサンプルの善し悪し、顕微鏡の使い方も含めて確認できれば最高ですね あとは、複数回走査して平均化すると綺麗になったりしますか？ web.cc.yamaguchi-u.ac.jp/~jikken11/lsm.htm 倍率による明るさの変化は下のページのObjective Brightness Indexが参考になるかと思います。共焦点だとちょっと違うかも？良く分からないまま書き込んですみません。 www.olympusmicro.com/primer/photomicrography/fluorescenceerrors.html

(無題) 削除/引用 No.3170-3 - 2014/06/30 (月) 11:12:42 - おお 倍率をあげると感度はさがります。confocalは平面上のものを観察していて、それより上下にあるシグナルはカットされています、その分つよいレーザー光で補ってますが、通常の蛍光顕微鏡でみえるぐらいであればはっきり見えてもおかしくはないぐらいの感度はあると思います。 顕微鏡のセットアップがしっかりしていればぼやけて見えるのは、ぼやけてるんでなくってそういう分布なのかもしれません。 油しんレンズをdryでみてたりするともしかしたらと、、、 レーザー光がもともと強すぎて載っけた途端ブリーチングしている可能性ももしかしたらあるかもしれません。 通常の顕微鏡では固定前にかんさつしたとかそう言うことはありませんか?

光学切片の厚さやNAなど 削除/引用 No.3170-2 - 2014/06/30 (月) 10:21:46 - mimikku 柴様 ご使用の顕微鏡システム・対物レンズにもよりますが、 レンズの倍率が上がるとNAも上がりますので20倍で観察できるのでしたら40倍でも見えるのではないかと思います。 また、共焦点では蛍光が弱くても”ぼんやりした画像”には原理上なりにくいかと。 顕微鏡トラブル（画像が見えにくいなど）でよくあるのは下記になります。 １．水やOilが水浸・油浸レンズに正しく載っていない。 ２。ガルバノミラー方式共焦点顕微鏡使用時、ピント合わせや視野探しのために20倍観察時点でサンプルのBleachingが起こっており、40倍使用時には蛍光が退色している。 ３．対物レンズが汚れている。 もっとも、一番頼りになるのは同じ顕微鏡をよく使っている方からのアドバイスになります。 もし設備管理担当などいたら、一度画像を見てもらってもいいかと思います。 以上、思いつくままですがよく聞くお話をあげてみました。

共焦点顕微鏡でのGFP観察/倍率を上げると見えない 削除/引用 No.3170-1 - 2014/06/30 (月) 09:17:59 - 柴 組織のGFP蛍光を試みたところ、 ・光学顕微鏡観察モードでは見える ・レーザ顕微鏡検鏡モードの対物レンズx20では、レーザーの出力を最強にすれば見える（ただし形がだいぶぼんやりしている） ・レーザ顕微鏡検鏡モードの対物レンズx40では、レーザーの出力を最強にしても見えない という状況でした。大変初歩的な質問でお恥ずかしいのですが、これの意味するところは「40倍で見るには蛍光が弱すぎる」ということでしょうか？ なお20倍で見える像も辛うじて形がわかる程度の粗さで、よく写真で見るような鮮明な像とは程遠く、解像度をいじっても改善しないのですが、これも蛍光の弱さによるものなのでしょうか？

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