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cytospin, 免疫染色後の染色体形態のダメージ トピック削除
No.3165-TOPIC - 2014/06/28 (土) 04:10:46 - chromosome
研究室にて、培養細胞の分裂中期染色体標本をサイトスピンで作製し、免疫染色を行う実験を立ち上げています。
プロトコールはPublishされている一般的なもので、
中期の細胞を遠心分離により収集し、hypotonic bufferに懸濁し、インキュベートしたのちサイトスピンで600rpm 5minでスライドにはりつけています。
サイトスピン後は　PFA固定、tritonによる透過処理を行い、免疫染色を行っています。

しかしながら、どこかの過程で問題があるのか、免疫染色後に観察を行うと、染色体の形状がのびきったようになっている場合が多くあります。ためしに免疫染色前の標本も観察しましたが、やはりのびた染色体が見られました。

自分なりに考えている原因は以下の二つです。
１．細胞を収集した後、先を切った1000µlのピペットを使って、pipettingすることでhypotonic bufferに懸濁している。この操作により染色体の形状が壊れる。
2. サイトスピンを行う際に、high accelerationにしているので染色体の形状が壊れる。

今後、以上の点を変更してみようと思っていますが、もし皆様の中にご経験のおありの方がおられましたら、染色体形状のダメージの原因をぜひ教えていただけると有難いです。
　
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(無題) 削除/引用
No.3165-3 - 2014/06/29 (日) 01:47:42 - chromosome
L様、

お返事ありがとうございます。説明が不十分ですみません。
目的は一般的なmetaphase spreadsですが、その後タンパク質をターゲットとした免疫染色を行うため、タンパク質を壊さないPFA固定を行っています。

のびきっている染色体というのは個々の染色体のことです。
一つの細胞のmetaphase spreadsのすべての染色体がのびきっているときもあれば、数本だけがのびきっているときもあります。
のびきった染色体は、通常の染色体の長さの数倍、時には５−１０倍くらいの長さになっていて、形状もきれいではありません。
acrocentricな染色体で構成された核型を見ていますが、形状が保持されている染色体と、のびきっている染色体は明らかに異なっていて、何らかの物理的な力によって染色体の形状が壊れていると見えます。

cytospinのほうも論文で報告されている回転数、時間を使用していますが、少し他の条件も検討してみようと思います。

(無題) 削除/引用
No.3165-2 - 2014/06/28 (土) 23:32:21 - L
実験の目的がわかりづらいのですが、個々の染色体をバラバラにはりつけたい（一般的なmetaphase spread）のか、metaphaseの細胞においてalignした染色体の集合体をそのままの形状ではりつけたいのか、どちらでしょう？　

前者であれば、hypotonic buffer処理後、メタノールと酢酸の混合液で固定してスライドグラスにドロップする方法の方が、cytospinより一般的なように思うのですが。

後者であれば、coverslip上で培養後、直接固定して染色し、metaphaseの細胞を顕微鏡下で同定して観察すれば良いように思います。細胞分裂の過程は結構早く進行するので、metaphaseの細胞を分離しても、固定しないでbuffer処理をやっているとanaphaseに入ってしまいます。

上記の問題と関連しますが、伸び切っているというのは、個々の染色体の事なのか、染色体の集合体の事なのかによって、異なる話になります。後者であればcytospinの影響かと思いますが、前者の場合はどうですかね。Acrocentricな染色体の場合、sister chromatidがcentromereでのみ繋がっている時には伸びた形に見えます。

Hypotonic bufferは細胞の膨張目的で、細胞を壊すわけではないので、懸濁の際のpipettingで染色体が直接機械的なダメージを受けるとは考えにくい気がするのですが、どうなんですかね。

cytospin, 免疫染色後の染色体形態のダメージ 削除/引用
No.3165-1 - 2014/06/28 (土) 04:10:46 - chromosome
研究室にて、培養細胞の分裂中期染色体標本をサイトスピンで作製し、免疫染色を行う実験を立ち上げています。
プロトコールはPublishされている一般的なもので、
中期の細胞を遠心分離により収集し、hypotonic bufferに懸濁し、インキュベートしたのちサイトスピンで600rpm 5minでスライドにはりつけています。
サイトスピン後は　PFA固定、tritonによる透過処理を行い、免疫染色を行っています。

しかしながら、どこかの過程で問題があるのか、免疫染色後に観察を行うと、染色体の形状がのびきったようになっている場合が多くあります。ためしに免疫染色前の標本も観察しましたが、やはりのびた染色体が見られました。

自分なりに考えている原因は以下の二つです。
１．細胞を収集した後、先を切った1000µlのピペットを使って、pipettingすることでhypotonic bufferに懸濁している。この操作により染色体の形状が壊れる。
2. サイトスピンを行う際に、high accelerationにしているので染色体の形状が壊れる。

今後、以上の点を変更してみようと思っていますが、もし皆様の中にご経験のおありの方がおられましたら、染色体形状のダメージの原因をぜひ教えていただけると有難いです。
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