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(無題) 削除/引用 No.3158-5 - 2014/06/29 (日) 00:04:07 - L まず、２種類の細胞がどちらも培養で増殖しているならば、どちらもBrdUを取り込むはずですので、一回目の実験で細胞�@のBrdU取り込みが検出できなったのであれば、その実験に何らかの問題があったと考えられます。ネガコンは薬剤処理などでS-phase entryを抑えた細胞（処理開始時に既にS-phaseに入っていた細胞がG2に出るのに十分な処理時間を取る）を用いた方が良いかもしれません。 指数増殖期にある細胞をある薬剤で処理したところ、DNA量には変化がなかったのに、BrdUの取り込みが完全に抑制された、という経験があります。この時は、薬剤により細胞周期が完全に止まり、G1だけでなくSやG2の細胞もそこで止まってしまったためDNA量に変化が出ないと解釈しました。monさんのコメントにあるように、DNA量による細胞周期の推定は、静的なアッセイである点でBrdU取り込みとは異なるという事ですね。 仮に、細胞�Aのdoubling timeが２０時間、S-phaseの割合が10%で指数関数的に増殖しているとすると、単純に考えて、この細胞がS-phaseを通過するのに２時間かかる事になります。１時間の処理だと、処理開始時にS-phaseの前半にあった細胞は処理している間取り込みを続けますが、処理中にS-phaseに入った細胞やS-phaseから出て行った細胞はS-phaseにいた時間しか取り込みません。結果、細胞によってBrdU取り込み量が異なる事になり、きれいなピークにはなりません。処理時間を長くするとピークが見れると思いますが、この場合は細胞周期が回っていない細胞をBrdU陰性細胞として検出する事になり、実験目的に合っているかどうは、私にはわかりません。

(無題) 削除/引用 No.3158-4 - 2014/06/27 (金) 04:44:33 - mon もう一点、BrdUを加えるときに培地の温度が下がらないように工夫していますか？ duplicate or triplicateで行っていますよね？

(無題) 削除/引用 No.3158-3 - 2014/06/26 (木) 15:11:28 - mon (1)S期の割合(G1,G2/M)は、DNA量でみているのですよね？ (2)細胞�@と�Aの倍加時間は同じですか？もし異なるとすると細胞内への取り込み活性や核酸代謝活性が異なるかもしれない。 (3)BrdUを取り込ませたあと、すぐにFITC標識抗体で検出しているのですか？しばらく培養しているのですか？ フローの差＝DNA量なら静的な差なので、S期で止まっている細胞が多いのかも。 動的なBrdU取り込み量＝合成されたDNA量＝＞S期を進行している細胞。 PCNA量もS期に最大になるのである程度の指標になります。

(無題) 削除/引用 No.3158-2 - 2014/06/26 (木) 12:33:27 - ~ 細胞の種類とBrdU取り込み時間については書かれていますが、 細胞の状態については情報がありませんね。 継代回数や播種後の時間等で細胞の状態が変わることはありますが、 各実験ごとにコントロールされていますか？

BrdU Flowの結果のばらつき 削除/引用 No.3158-1 - 2014/06/26 (木) 11:44:55 - kenkyuusitu 研究室に所属する学生です。 現在BrdU Flowを行っているのですが、実験を行うたびに結果にばらつきがあり、悩んでいます。 細胞を２種類用意しており、こちらの予想では細胞�@がBrdUの取り込みが少ない（S期の割合が少ないことをフローで確認済み）�AがBrdUの取り込みが多い（S期の割合が多いことをフローで確認済み）としています。 BrdUの取り込み時間を、15分、30分、1時間で条件検討していました。 30分と1時間で、細胞�Aは標識してあるFITCのピークの動きがみられ（ピークがわれた）たため、1時間で再び実験を行いました。 しかし前回と比べて�@のピークも動いたようにみえ（われてはいない）、�Aは前回とは異なりピークはわれることなく、�@と似たような幅広いヒストグラムになりました。 この結果を受けて、1時間ではBrdUの取り込みが長過ぎたのかと思い、今回は45分にしてみました。しかし、あまりピークの動きは見られませんでした。 始めに行った時にきれいに結果に差が見られたため、実験の手法に問題がないか検討したいと考えているのですが、なかなか解決されません。 BrdUに詳しい方がいらっしゃいましたら、何かアドバイスお願いできないかと思います。 そもそもBrdUの取り込み時間は毎回時間の検討をしなければならない程変動することはあるのでしょうか？ また、BrdUの取り込み時間以外に、何か重要な工程などありましたらお聞きしたいです。 フローでS期の割合の差（２倍程度違う）を確認しているため、BrdUで差がないと結論づけるとどのように解釈してよいのか分かりません。

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