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(無題) 削除/引用 No.3157-15 - 2014/07/02 (水) 01:25:13 - おお BN PAGE はCMC以上のでたーじぇんとで可溶化しておいて、ゲルにはdetergentを入れないパターンがありますね。電離しないdetergentがよく使われるので、そう言うのはほかの助けがないとゲルに入らないですが、そんな状態でもあぐらずきれいに分離される蛋白があるわけですから、一度可溶化した蛋白を溶液で維持するのに必ずしもCMC以上の高い濃度のdetergentが必要とはかぎらないとそう言うことからもいえると思います。

(無題) 削除/引用 No.3157-14 - 2014/07/01 (火) 11:53:51 - おお >[Re:13] macdonald'sさんは書きました : > ＞理想的にはそうだけど、現実的にはそうとも限らないかもよとかいたつもりですが。 > > 理想的には（化学でいうところの理想状態、簡略化した考え方） 別に化学というわけではないですが。一般の定義でいいですよ。 >ミセルサイズの問題で、ゲルのポア内でミセルを形成出来ないから沈殿する可能性がある、 ゲルのポアを通過しなければ外を通過するんですが、なぜ沈殿すると? 蛋白がでたーじぇんとなしでポアにはいると思うからですか? 蛋白の疎水性のぶぶんにデタージェントがついていればミセルがなくても沈殿しないケースは多いと思いますが、、、各種デタージェント除去用キットはミセルだけゲル濾過などで溶液から除くという発想です。 それにミセルがポアを通過しないかもしれないという発想があるなら、ミセルのサイズを確認してみてはどうでしょうか。TRITON X100なら 80kDaぐらい。 http://www.sigmaaldrich.com/img/assets/15402/Detergent_Selection_Table.pdf >もしくは、ミセルに取りこまれているからかなり大きめのポアでないと入り込めない。でも現実は界面活性剤が入っているだけで、普通のゲルろ過と同じという場合が多い。 > という解釈でよろしいですか？ ミセル内に蛋白が入り込むか、蛋白の表面にデタージェントがついた状態でミセルに入ってないかとかは、それぞれの事例で違いそうな気がしますので、一つの解釈を持ち込むのはどうでしょうか。 > > ＞沈殿はよくわかりませんが、可溶化でみせるができるCmc濃度以上でおこない、精製、維持のためにはCMC濃度以下にすることは珍しくないですよ。 > > CMC以下にしたことはないので自らの試料で検証してみますが、一応ご経験を伺いたいのですが、CMC以下に希釈しても沈殿しないものなのでしょうか？ 経験的には沈殿するものも、しない物もあったといっておきます。TX-100はCMCがかなり低いのでかなり濃度を下げないといけないというのもあります。ほかCHAPSはCMCは0.5%ぐらいですし、1%とかで抽出して0.1%ぐらいで維持というのはよくあるとおもいます。 あと理想的とかいたのは、たとえばサンプルに0.1%のTX-100がはいっていてカラムも同じ濃度で平衡化してあったとして、サンプルが入っている溶液と平衡化につかったbufferは環境が一緒かというはなしです。塩濃度、pH、蛋白量、またはその他サンプルからくるもの(脂質とか)が入った状態で環境が一緒といえないなら、ミセルのサイズ、形成の度合いなど違ってもおかしくはないですか。それが原因でベースラインが動く可能性があるんじゃないですかといいたかったのです。 あと沈殿も溶液のでたーじぇんと濃度を単に低くした場合は沈殿しないけどカラムに乗せると、吸着してしまうという場合はあります。

(無題) 削除/引用 No.3157-13 - 2014/07/01 (火) 10:07:22 - macdonald's ＞理想的にはそうだけど、現実的にはそうとも限らないかもよとかいたつもりですが。 理想的には（化学でいうところの理想状態、簡略化した考え方）ミセルサイズの問題で、ゲルのポア内でミセルを形成出来ないから沈殿する可能性がある、もしくは、ミセルに取りこまれているからかなり大きめのポアでないと入り込めない。でも現実は界面活性剤が入っているだけで、普通のゲルろ過と同じという場合が多い。 という解釈でよろしいですか？ ＞沈殿はよくわかりませんが、可溶化でみせるができるCmc濃度以上でおこない、精製、維持のためにはCMC濃度以下にすることは珍しくないですよ。 CMC以下にしたことはないので自らの試料で検証してみますが、一応ご経験を伺いたいのですが、CMC以下に希釈しても沈殿しないものなのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3157-12 - 2014/07/01 (火) 01:16:14 - おお >[Re:11] macdonald'sさんは書きました : > カラムが可溶化と同じバッファーで平衡化できてればミセルの大きさは気にしなくても 理想的にはそうだけど、現実的にはそうとも限らないかもよとかいたつもりですが。 >カラム内で沈殿することは無いということでよろしいですか？ 沈殿はよくわかりませんが、可溶化でみせるができるCmc濃度以上でおこない、精製、維持のためにはCMC濃度以下にすることは珍しくないですよ。

(無題) 削除/引用 No.3157-11 - 2014/06/30 (月) 22:06:32 - macdonald's カラムが可溶化と同じバッファーで平衡化できてればミセルの大きさは気にしなくてもカラム内で沈殿することは無いということでよろしいですか？

(無題) 削除/引用 No.3157-10 - 2014/06/28 (土) 02:05:26 - おお >[Re:7] macdonald'sさんは書きました : > 全てのバッファーにTritonいれておけば全てのフラクションに均一にtritonが存在すると勝手に考えていたのですが、どこかに濃縮してしまうのでしょうか？ みせるのサイズが問題になるわけですが、、、ローディングの濃度と溶出用バッファーに開きがあったり、カラムが完全に平衡化できてなかったりすると(detergent freeのバッファーよりけっこう量いるかもしれない)そう言うことがあるのではとおもいます。 ローデェィングのtritonの濃度が溶出用バッファーがいっしょでも、環境(塩濃度、蛋白などによる影響)でみせるの状況が違うかもしれませんので、溶出してきたフラクションに変動があることはあり得ると思います。 抽出直後なら通常蛋白を可溶化した状態で使う、保存する濃度より高い界面活性剤を使うでしょうし、抽出後すぐにゲル濾過なら顕著にみせるの挙動がみれるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3157-9 - 2014/06/27 (金) 23:25:14 - macdonald's おお様、qw様ありがとうございます。 実験書やメーカーの説明書には書いてないことばかりで、大変勉強になります。 不勉強で申し訳ありません。Giとは何の略でしょうか。 文献を調べてみたい思います。 界面活性剤で可溶化されている疎水性タンパク質のゲル濾過について全くイメージがつかめていません。担体を選ぶ際は界面活性剤のミセルの大きさで選ぶのか、ミセル状であることは無視してタンパクの分子量を基準に選ぶのか、どちらでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3157-8 - 2014/06/27 (金) 22:40:32 - qw 可溶化に使うtritonと溶出に使うtritonが同じ濃度であれば、おおよそ同じtriton濃度になるかもしれません。 可溶化するときに濃い目のtritonを使うとすると、その濃度のtritonは分画したどこかにピークとなって出ます。 また、可溶化するときにリン脂質なども同時に可溶化されて、tritonとリン脂質の混合ミセルになるでしょう。ゲルろ過で溶出される混合ミセルは、カラム中のトリトンを吸収しながら、もしくは放出しながら移動するでしょうから、その中のtriton濃度は容易には推定する事ができません。 タンパクが溶けているのであれば、胆汁酸（コール酸やデオキシコール酸）やその抱合体（CHAPS）を使ってゲルろ過する手はある。特にコール酸は比較的安く弱アルカリ性であれば使い勝手もそれほど悪くないと思います。Giのpurification辺りを参照されると良いです。

(無題) 削除/引用 No.3157-7 - 2014/06/27 (金) 09:59:28 - macdonald's 全てのバッファーにTritonいれておけば全てのフラクションに均一にtritonが存在すると勝手に考えていたのですが、どこかに濃縮してしまうのでしょうか？ 私の狙っているタンパクは界面活性剤を入れないと可溶化できないことは試験済みです。

(無題) 削除/引用 No.3157-6 - 2014/06/26 (木) 23:11:36 - おお BCAならtritonによるぶれは少ないかもしれません。triton x-100などはミセルは非常に大きくなるので、わけたいレンジからはなれているとbradfordでも差ほどもんだいにならないかもしれません。 限界ミセル濃度以下で流せるならそう言う手もありますが、けっこう低くしないといけないので、一度それで蛋白があぐらないか確認する方がいいかもしれません。限界ミセル濃度以下ならもしかしたら、濃度が高くないのでUVでもいけるかもしれませんね。 UVも核酸、その他のピークもひろうので蛋白を見てるとも限らないとはいえると思います。

(無題) 削除/引用 No.3157-5 - 2014/06/26 (木) 21:30:52 - qw ゲルろ過で出てきたfractionの一部を希釈してBradfordでタンパク定量しても、ゲルろ過にロードしたサンプル中の濃いtritonのミセルもどこかに溶出されていて、それをタンパクと間違えてbradfordで検出してしまう可能性があるだろうなと、言うことです。

(無題) 削除/引用 No.3157-4 - 2014/06/26 (木) 19:55:06 - macdonald's >ゲルろ過であれば、TritonX100のミセルがかなり大きいので、無理かもしれません。 界面活性剤を使うとミセルを形成するためにゲル濾過による分子量の見積もりはもちろん、分画自体難しということでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3157-3 - 2014/06/26 (木) 18:35:50 - qw UV吸収に頼らない選択もありえます。 NP40やTritonと競合しない蛋白定量を96wellプレートで行えば、良いのではないでしょうか？ 十分に希釈した条件で、Bradfordでタンパク定量するのがよいと思いますが、ゲルろ過であれば、TritonX100のミセルがかなり大きいので、無理かもしれません。 もしくは、溶出液の一部をろ紙かニトロセルロース、PVDFなどにブロットして、適当な色素で検出するのが現実的かもしれません。（過去にそのような実験方法でNaKATPaseを精製した報告があります。） それ以外には、SDS-PAGEでタンパクパターンを確認するのがよいと思います。うまくすれば、1時間以内で泳動・検出が可能かもしれません。 UV測定は気安めですから、あまり固執する必要もないでしょう。 精製が進んでスケールダウンしたところでは、高めのデタージェントを使ってもいいんじゃない？

(無題) 削除/引用 No.3157-2 - 2014/06/26 (木) 15:51:30 - おお ゲル濾過のまえにある程度精製されて濃縮された状態に持っていけば、ゲル濾過のカラムサイズを小さくできると思います。

膜タンパクの精製 削除/引用 No.3157-1 - 2014/06/26 (木) 11:08:14 - macdonald's 膜酵素の精製を行いたいのですが、UV吸収が少ない界面活性剤は高額であります。ゲル濾過などバッファーを大量に使うと思います。みなさん、どのように節約しているのでしょうか？ アドバイスをいただければ幸いです。

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