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(無題) 削除/引用 No.3153-5 - 2014/06/26 (木) 04:27:03 - おお http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17094801 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6707117 こういうのもあるよ。NAD/NADPをほ酵素とする蛋白なら結合する可能性があるので、cytochromeを除くことができるかもしれない。

(無題) 削除/引用 No.3153-4 - 2014/06/25 (水) 22:08:39 - ｃDNA イオン交換カラムはなんでもいいと思うので、汎用性の高そうなものがいいですね。カラムは手詰めですか？システム使ってますか？ 手詰めなら本当に何でもいいし、システム使っていて1mLや5mL程度のカラムならHiTrap DEAE FFあたりがコストパフォーマンスはいいと思います。 http://www.gelifesciences.co.jp/catalog/0084.html 膜タンパクならチトクロムは主にチトクロムboだと思うので、本来ならHis-tagよりは結合が弱いもんなんですが、目的タンパクもちょっと結合が弱めなんでしょうね。コンストラクトから変えることも視野に入れるなら6xHisから10xHisにすると結合性が高くなったりします。 お金に余裕があるならNiカラムだけじゃなくて、TALONに変えると分かれることもあると思います。 と、ここまで書いて読み返したら、500mMで溶出ですか？目的タンパク質は何mMで溶出しますか？それが分かったら、溶出しないギリギリの濃度で大目に洗う方がグラジエントより効率的です。 450ならフラボタンパクですかね。今は赤と混ざってオレンジかな。赤が完全分離して綺麗な黄色が出てくると嬉しいですね。

(無題) 削除/引用 No.3153-3 - 2014/06/25 (水) 19:08:15 - MM >>cDNAさん 回答ありがとうございます。 説明が不十分ですいません。 目的タンパクは膜タンパク質で、界面活性剤はDDMを使用しています。 イオン交換は想定していませんでした。 カラムは何にするかは条件検討しかありませんよね...？

(無題) 削除/引用 No.3153-2 - 2014/06/25 (水) 18:02:54 - ｃDNA 膜タンパクですか？ イミダゾール濃度を振っても全く同じ濃度でしか溶出しないなら、他の方法で分けるしかないと思います。目的タンパク質とそのチトクロムが分かれるイオン交換などをしてからNiカラムで分けるとか。逆でもいいですけど。

チトクロムと目的タンパクの分離方法について 削除/引用 No.3153-1 - 2014/06/25 (水) 17:41:12 - MM 大学院生です。 大腸菌発現系、pETベクターにてタンパク発現を行い、Niアフィニティ精製により目的タンパクを精製しています。 吸収スペクトルを測定すると410 nm付近にチトクロムと思われるピークが見られます。目的タンパクの吸収が450 nm付近にピークがあり、チトクロムと思われるピークとかぶってしまいます。 410 nmのAbs＝0.8 450 nmのAbs＝0.6　 質問です。 チトクロムと思われるピーク(410 nm)を小さくする方法ってありませんか？ 目的タンパクはこれ以上発現量が増やせない状況です...。 Wash　Bufferのイミダゾール濃度20 mM Elution Buffer が500 mMです。 Elution　Bufferのイミダゾール濃度30、35、40、45、50、100、150 mMと変えてもチトクロムと思われるものと目的タンパクは分離できませでした。 誰かアドバイスお願いします。

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