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目の凍結切片 トピック削除
No.3152-TOPIC - 2014/06/25 (水) 11:59:25 - ユウスケ
目の凍結切片

とある大学の研究室に在籍している大学院生です

現在私達の研究室では脳の凍結切片を作製し、蛍光免疫染色法を用いて組織の解析をしております。
今回、脳だけではなく眼もサンプル化したいと考えました。
サンプル化後の解析方法はまだ未定ではありますが、主に免疫染色を用いる予定です。

現在私達は
・解剖後、4%PFAで4℃一晩インキュベート
・３時間ごと段階的に20%スクロースで置換後4℃一晩インキュベート
・ O.C.Tで包埋
・ −80℃保存
という方法で脳のサンプルを作製しております。

眼においても同様の方法で包埋可能でしょうか？
私個人、インターネットで色々調べてみると「脱灰」とういう操作が必要になる場合もあるようです。

どなたか「こういう方法で眼のサンプル作っているよ！」って方はいらっしゃらないでしょうか？
その他ご意見などありましたらご享受いただけないでしょうか。よろしくお願いします。
　
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(無題) 削除/引用
No.3152-7 - 2014/06/30 (月) 14:17:24 - ユウスケ
AAさん
ありがとうございます。サンプルを切る際の向きも重要なんですね。参考にさせていただきます。

取りあえずこれをもちまして、いったん解決とさせて頂きます

皆様からいただいたアドバイスを参考に試行錯誤していきます。
ありがとうございました。

どこかでまた見かけた時は、またよろしくお願いします

(無題) 削除/引用
No.3152-6 - 2014/06/25 (水) 17:43:32 - AA
眼は水晶体が固いので凍結切片の時は、
網膜側から切り始めて水晶体側に切り抜けるように、
サンプルをセットして切るといいです。

あと、灌流固定をすると縮むためか網膜が硝子体から剥離してしまうので、
生のまま解剖して固定液へ一晩漬けるのがいいです。
固定液もPFAよりはDavidson液をおすすめします。

(無題) 削除/引用
No.3152-5 - 2014/06/25 (水) 16:49:51 - ユウスケ
emaさんありがとうございます
フィルム法というものもあるのですね。恥ずかしながらそのようなものは初めて知りました。参考にさせて頂きます。

固定に関しては、もし現在私達が行っているような固定方法で眼のみを包埋した場合、何か不都合な事があるでしょうか？

他の方からのご意見もありましたらご享受お願いします。

眼ののどこまで 削除/引用
No.3152-4 - 2014/06/25 (水) 12:52:12 - ema
眼球だけを切り取るなら脱灰（というかカルシウムどこ？？）処理はいりません。骨込で周辺もいっしょならいると思いますが。
たぶんみたサイトは骨、眼球、皮膚など硬いもしくは硬さの異なるものが一緒になっている難しいサンプルのやり方、
http://www1.med.u-fukui.ac.jp/CRL/seminar/2004/cryo-seminar-houkoku.html
かな、と思います。
脱灰は骨にだけで、眼球、皮膚は異なる硬さのサンプルなのでOCTに入れていても刃で切ってる時に押しつぶされて像が異なるので、フィルム法を使用していると思います。
私自身ではないですが、うちのほかの研究者で眼球をスライスしている人は一応通常法OCT法でも大丈夫でした。（コツがあるかもしれないですがそこまでは把握してないです）
私は骨のフィルム法できれいにできます。
この時のこつはフィルムの有効期限・専用のOCT（費用はかさむんですがきれいのため）凍結の仕方（イソペンタン法）でした。

(無題) 削除/引用
No.3152-3 - 2014/06/25 (水) 12:14:32 - ユウスケ
申し訳ありません。

扱っている動物はマウスです。

(無題) 削除/引用
No.3152-2 - 2014/06/25 (水) 12:05:10 - AP
材料生物種を言わないとは、蛸壺的思考、視野狭窄に陥っていると言えよう。

目の凍結切片 削除/引用
No.3152-1 - 2014/06/25 (水) 11:59:25 - ユウスケ
目の凍結切片

とある大学の研究室に在籍している大学院生です

現在私達の研究室では脳の凍結切片を作製し、蛍光免疫染色法を用いて組織の解析をしております。
今回、脳だけではなく眼もサンプル化したいと考えました。
サンプル化後の解析方法はまだ未定ではありますが、主に免疫染色を用いる予定です。

現在私達は
・解剖後、4%PFAで4℃一晩インキュベート
・３時間ごと段階的に20%スクロースで置換後4℃一晩インキュベート
・ O.C.Tで包埋
・ −80℃保存
という方法で脳のサンプルを作製しております。

眼においても同様の方法で包埋可能でしょうか？
私個人、インターネットで色々調べてみると「脱灰」とういう操作が必要になる場合もあるようです。

どなたか「こういう方法で眼のサンプル作っているよ！」って方はいらっしゃらないでしょうか？
その他ご意見などありましたらご享受いただけないでしょうか。よろしくお願いします。
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