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(無題) 削除/引用 No.3148-7 - 2014/06/24 (火) 21:02:45 - TS http://www.etonbio.com/sequencing/troubleshooting.php

(無題) 削除/引用 No.3148-6 - 2014/06/24 (火) 16:21:09 - N シークエンスが読めていないにも波形データから何が原因かを推定できる可能性もあるので、いつもと比較してどのように読めなかったか書いて頂けるとよいかと思われます。 サンプルが制限酵素を用いたcut checkでいけていそうで、なおかつprimerがworkしているものなのにシークエンスが読めない時は、シークエンスをかける際のパラメーター設定でミスっているケースが割と多いです。このケースの波形データの特徴は始めにNがいくつか並んだあとに、Nさえ表示されなくなっています。

(無題) 削除/引用 No.3148-5 - 2014/06/24 (火) 14:43:23 - mon まず、PCRではなくサイクルシークエンシング反応ですね（primerは片側だけなので）。 シーリングが不十分で、溶解液(Formamid）が吸湿したのかも？

(無題) 削除/引用 No.3148-4 - 2014/06/24 (火) 12:49:50 - Harmonia > そもそもサンプルDNAに対してPCR反応が起きていないという可能性 すぐできますよね。確認した結果、どうでした？

(無題) 削除/引用 No.3148-3 - 2014/06/24 (火) 12:31:21 - 774R 例えばですけど、96well plateで4サンプルずつシーケンスしていく装置の場合なんかですと、それこそシーケンス待ちのサンプルは常温でO/Nなどザラですし、シーケンサーのメーカーがそのような方法を採用していることから考えても、4℃でO/Nはなおさら問題がないと思えます。

(無題) 削除/引用 No.3148-2 - 2014/06/24 (火) 12:18:26 - 774 私のところは共通機器のオペレーターにエタ沈して乾燥させてから渡すのですが、 ４℃保管してもらって、翌日にかけても問題なく読めてます。 （金曜日に渡して月曜日にかけてもらったことも合ったような気もします。） なので、オーバーナイト自体は大丈夫なんじゃないでしょうか？

シークエンスにかけるまでのサンプル保存について 削除/引用 No.3148-1 - 2014/06/24 (火) 12:13:18 - シークエンス いつもお世話になっております。 先日、BigDye3.1でPCR後にエタ沈で精製し、シークエンスプレートに移した後、４度でオーバーナイトして翌日にシークエンサーにかけました。 結果を見るとシークエンスが読めておらず、なぜだろうと思いました。 そもそもサンプルDNAに対してPCR反応が起きていないという可能性もあるかと思いますが、プライマーもこれまでずっと使用してきているものですし、サンプル自体もDNA cut時点では問題なかったものです。 いつもと違う点はシークエンスをかける前に４度でオーバーナイトしたところが問題だったかと思いましたが、このような操作によって読めなくなることはあるのでしょうか？ なぜオーバーナイトしたかと言いますと、シークエンサーが共通機器であり、使用可能な時間に合わせて精製するのが困難であったためオーバーナイトした次第であります。 読みたいベクターはレンチやsh-RNAのベクターではありません。 ご教授よろしくお願いします。

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