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(無題) 削除/引用 No.3144-11 - 2014/06/26 (木) 09:33:34 - おお >[Re:10] 名無しさんは書きました : > ジギトニン試してみた？Mtの外膜は溶かすけど内膜は傷つけないと昔習ったんだが。 mitochondriaは(たぶん)いんたくとの状態でその核を除いたものからえられています。見つけてきて張ってあるリンクによれば核のミトコンドリアのコンタミはdetergentをつかわないと難しいようなので、、、 ただきれいな核を精製するのが目的でもなく、、、このままの状態でなんとか図にできないかと、わるあがきしてます。 >[Re:9] qwさんは書きました : > mitochondriaをconfocalで観察すると、核を串刺しにしたミトコンドリアが見つかる場合もある。 > mitochondriaのfission-fusion関連で、aggregateしたmitochondriaが核周辺に付随している。intactな肝臓細胞で特に多いと言うような報告があったような気がする。 > ありがとうございます。核の周辺(perinuclear)にmitochondriaが集中してみられるので、核膜から突出するERに接触しているんでしょうか。ER-mitochondria contact siteはいろいろと調べられてきているようですし、しめしたリンクではそ精製ではmitochondriaは混じるとかいてますし。

(無題) 削除/引用 No.3144-10 - 2014/06/26 (木) 00:22:04 - 名無し ジギトニン試してみた？Mtの外膜は溶かすけど内膜は傷つけないと昔習ったんだが。

(無題) 削除/引用 No.3144-9 - 2014/06/25 (水) 22:04:03 - qw mitochondriaをconfocalで観察すると、核を串刺しにしたミトコンドリアが見つかる場合もある。 mitochondriaのfission-fusion関連で、aggregateしたmitochondriaが核周辺に付随している。intactな肝臓細胞で特に多いと言うような報告があったような気がする。

(無題) 削除/引用 No.3144-8 - 2014/06/23 (月) 01:40:36 - おお ミトコンドリアの蛋白のコンタミの割合はcytosolの蛋白のコンタミの割合を考えるとオーダーで1以上違うという感じです。なので壊れてない細胞由来のものよりも単純に10倍はおおいともいえます。

(無題) 削除/引用 No.3144-7 - 2014/06/23 (月) 00:26:12 - み ｲﾝﾀｸﾄな細胞が残ってる可能性はない？

(無題) 削除/引用 No.3144-6 - 2014/06/22 (日) 07:46:21 - おお http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/0471140864.ps2402s44/full just taking a note

(無題) 削除/引用 No.3144-5 - 2014/06/21 (土) 23:03:23 - おお >[Re:2] ｃDNAさんは書きました : > 核フラクションの取り方によります。 > 細胞を壊して最初の沈殿を核フラクションとよく呼びますが、ここにはミトコンドリアは結構入っていますので、それをさらにショ糖の密度勾配にかけます。 > その様なサンプルでしたら細胞が余り壊れていないとかでしょうか。 ショ糖の密度勾配はしてないですね。。。壊れてない可能性は、、、何ともわかりません。ただミトコンドリアフラクションをとった残りの核を念のためhypotonic buffer + 0.1%NP-40であらい。without NP-40でさらに二回ぐらいあらってます。

(無題) 削除/引用 No.3144-4 - 2014/06/21 (土) 22:58:19 - おお >[Re:3] 名無しさんは書きました : > ミトコンドリアって、フリーで浮いてるっていうより微小管と相互作用したり、上に乗っかって微小管に沿って移動したりしてるって昔習ったんだがどうかな。 そうです。じっさいチューブリンやアクチンもミトコンドリアで検出されますし。ただアクチンはミトコンドリア内部にもあるという論文がありますが。 >また微小管って端っこが核膜のとこにくっついてたりとかするでしょ。そう考えると核フラクションにミトコンドリアが引っ張られてくることも、細胞の種類や状態によってはそれも有りかも、とか思うし、それはそれで重要な所見と思う。 重要な部分はあるのですが、今注目している蛋白の局在を調べていてそれを示そうとするマーカーを考えてまして、重要とまで持っていく展開までいたりませんというかいたれません。。。 > > ミトコンドリアのマーカーが常にミトコンドリアにしか局在しないか、と考えるとそういう保証もないと思うので（てか、このオルガネラ蛋白質、実は細胞膜画分にもありました、とかの論文たまにみるし）、何種類かミトコンドリアに局在すると考えられる他の蛋白質についてもWBでチェックして、みな一様に核フラクションに検出されるのか、 いまのところ試したすべてがそうです。何社か細胞器官分画用キットでも核フラクションにいろいろミトコンドリアの蛋白が検出されているようです。リファレンスが開ける状態の時に何か言及してないか調べてみようかと思います。 >物によるかも見て、総合的に判断した方がいいんじゃね。あと蛍光免疫染色で局在の確認することもこれは是非やってみるべきとおもう。 そうですね。ミトコンドリアに局在するとされているほぼすべての蛋白は細胞の染色像がすでにpublishされています。使っているマーカーでは核内という感じはそう言うのを見る限りないです。また、そう言及されているものもないです。ただ自分で確かめてみることは大事とはおもっています。

(無題) 削除/引用 No.3144-3 - 2014/06/21 (土) 22:07:36 - 名無し ミトコンドリアって、フリーで浮いてるっていうより微小管と相互作用したり、上に乗っかって微小管に沿って移動したりしてるって昔習ったんだがどうかな。また微小管って端っこが核膜のとこにくっついてたりとかするでしょ。そう考えると核フラクションにミトコンドリアが引っ張られてくることも、細胞の種類や状態によってはそれも有りかも、とか思うし、それはそれで重要な所見と思う。 ミトコンドリアのマーカーが常にミトコンドリアにしか局在しないか、と考えるとそういう保証もないと思うので（てか、このオルガネラ蛋白質、実は細胞膜画分にもありました、とかの論文たまにみるし）、何種類かミトコンドリアに局在すると考えられる他の蛋白質についてもWBでチェックして、みな一様に核フラクションに検出されるのか、物によるかも見て、総合的に判断した方がいいんじゃね。あと蛍光免疫染色で局在の確認することもこれは是非やってみるべきとおもう。

(無題) 削除/引用 No.3144-2 - 2014/06/21 (土) 18:12:35 - ｃDNA 核フラクションの取り方によります。 細胞を壊して最初の沈殿を核フラクションとよく呼びますが、ここにはミトコンドリアは結構入っていますので、それをさらにショ糖の密度勾配にかけます。 その様なサンプルでしたら細胞が余り壊れていないとかでしょうか。

mitochondrial markers in nuclei 削除/引用 No.3144-1 - 2014/06/21 (土) 16:40:38 - おお まんまるの細胞から核フラクションをとってくると、ミトコンドリアのマーカーが検出されます。トータルlysateと同じくらいの蛋白量のせると、トータルよりWBで強いバンドが検出されます。ミトコンドリア、膜フラクションを超遠心で除いたサイトゾルからはほぼ検出限界いかです。もちろんmitochondriaの蛋白からのシグナルが一番強いです。 ERを介して核膜につなぎ止められてるんでしょうか このことについて言及されているリファレンスに引けそうな文献ありませんでしょうか? 調べる予定でいますが、いま文献へのアクセスがほとんどできないので、、、

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