全15件 ( 1 〜 15 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用 No.314-17 - 2014/02/18 (火) 03:17:48 - おお I see.

(無題) 削除/引用 No.314-16 - 2014/02/18 (火) 02:32:26 - 中西部ポスドク This question was posted two years ago.

(無題) 削除/引用 No.314-15 - 2014/02/18 (火) 02:29:04 - おお Oh, it has been mentioned in No.314-9 .

(無題) 削除/引用 No.314-13 - 2014/02/18 (火) 01:54:10 - おお 確かmybだったかmyoDだったか、、、蛋白はなんだったかわかりませんがN-terminalにユビキチンがつくという発表があります。JBCとかだったと思いますが、、、蛋白や、ジャーナルに関してはかなりあやふやです。メチオニンというのは、N-末の事をいっているのかもしれませんね。

(無題) 削除/引用 No.314-12 - 2014/02/17 (月) 20:42:42 - 名無し SO RE, MA JI DE SU KA !!

(無題) 削除/引用 No.314-10 - 2012/03/22 (木) 20:56:11 - himawari 論文になっているかどうか確認していませんが、メチオニンとかにもユビキチンはくっつくそうです（特異的な酵素が存在）。

(無題) 削除/引用 No.314-9 - 2012/03/22 (木) 11:13:04 - 名無し 全てのK残基を潰してもN末端のアミノ基にユビキチンが入ってしまうと聞いたことがあります。 この場合は非生理的なのでしょうが、実際に生理的に（？）N末端がユビキチン化されるタンパク質があるそうです。GENES & DEVELOPMENT 18:1862–1874

(無題) 削除/引用 No.314-8 - 2012/03/20 (火) 15:59:12 - m 内在性のタンパクが検出出来ないって言うのは、「今使っている細胞で」ってことですよね。組織によっては大量に発現しているところがあって、そう言う物では検出出来るはずの抗体ですよね。 >内在性レベルで検出することができません と言うことですので、トランスフェクションしていない細胞でも一応IPして検出できなかったということですよね。面白そうですね。マスとかで同定できればいいですね。

(無題) 削除/引用 No.314-7 - 2012/03/20 (火) 15:47:50 - 反リア充 バンドとして検出されるという事はモノユビキチン化といういことかな。IP物をSDS-PAGEしてクマシーで染めた時、Ub化蛋白質Aが検出された部分にバンド見える？なんとか見えるようならそこ切り出してLC-MS/MSしてみれば。トリプシン消化したとき、もしユビキチン付いてればそこのLys/ArgのC末は切れないから、結果として枝分かれした変な形のペプチドが出来るはずだから、その情報から結合部位とか同定できるんじゃね。ていうかそこまでしないと、やっぱ現状ではどうやっても可能性の域を出ないと思う。 あと内在性の分子が検出出来ない抗体というのは大丈夫かなとか思う。そういう抗体使った事ないんで気になる。あとnormal IgG-beadsでのコントロールIPの方では検出されないことは確認済みということでいい？。いま問題になってるそのシグナルがIgG由来ということはないね。 Ub化のpull-downチェックは（遺伝子導入してO/Eでも別にいいというレベルなら）、His-tag とかで発現させて変性条件下で精製するのがub関係者のあいだではとりあえず一般的だと思うんだが、今回、蛋白質AをO/Eしてることから考えて、内在性の蛋白質の本当の姿をみるという目的ではないようなんだけど、それでもIPでないとマズい理由とかあるのかな。

(無題) 削除/引用 No.314-6 - 2012/03/20 (火) 13:32:55 - AP 過剰発現したタンパク質が単一のバンドに大量に存在するため、抗体の非特異的吸着でもそこだけ光って見える、とか。 内在性のタンパク質の存在量が少ないといいますが、抗体で検出できないなら抗体がよくないか、使っている細胞株がよくないか（好発現している細胞株でなければ生理的機能を果たしていないのかも）ということはないですか。

(無題) 削除/引用 No.314-5 - 2012/03/20 (火) 12:58:37 - MY mさん 返信ありがとうございます。 現在、研究しているタンパク質Aは、内在性レベルで検出することができません。 過剰発現させた時のみ、検出することができます。

(無題) 削除/引用 No.314-4 - 2012/03/20 (火) 12:25:09 - m 内在性の野生型タンパクが検出されている可能性は無いんですよねぇ…。

(無題) 削除/引用 No.314-3 - 2012/03/20 (火) 12:17:13 - MY 反リア充さん 返信ありがとうございます。 抽出は、非変性条件で行っています。 しかし、別のタンパク質のUb化を検出している可能性は、低いと考えております。 抗Ub抗体で検出した後、リプローブを行い、抗タンパク質A抗体で再び検出しました。 結果は、変異体サンプルにおいて、抗Ub抗体で検出したバンドと抗タンパク質A抗体で検出したバンドは一致しました。 このことから、タンパク質Aの変異体が、Ub化されていたと解釈しています。

(無題) 削除/引用 No.314-2 - 2012/03/19 (月) 21:34:17 - 反リア充 IPにつかう細胞ライゼートなんだが、抽出は非変性条件、それとも変性どっちかな。前者だとたとえば蛋白質Aにくっついてるような他の蛋白質も一緒に連れてくるからね。もしそれがUb化されていたらpull down でub鎖が検出されるとおもうよ。 これを回避するには、SDS入りbufferで変性条件で抽出した後に、非イオン性界面活性剤混ぜてIP出来るくらいまで希釈してSDS濃度下げてIPやるという手があるが、やや煩雑なので、普通はHis-tagみたく変性条件でも精製できるタグを蛋白質Aにつけたものを細胞に発現させて、それをニッケルカラムで精製したものをwesternするとかするのがよくやる方法と思う。

リシン以外のアミノ酸は、ユビキチン化されますか？ 削除/引用 No.314-1 - 2012/03/19 (月) 12:19:36 - MY 現在、あるタンパク質(A)のユビキチン化について、検討しています。 　タンパク質Aがユビキチン化されるという証明を行いたく、全てのリシン残基をアルギニンへ置換した変異体を作製し、以下の実験を行いました。 ・リポフェクトアミンを用いて、野生型および変異体を一過性に過剰発現する細胞を調整しました。 ↓ ・野生型および変異体に対する抗体を用いて、細胞抽出液から変異体を免疫沈降しました。 ↓ ・ウエスタンブロット法により、抗ユビキチン抗体を用いて、検出しました。 　結果は、野生型および変異体の両サンプルで、ユビキチン化されたタンパク質Aを検出しました。 　変異体でユビキチン化されたタンパク質Aを検出したことから、リシン以外のアミノ酸もユビキチン化を受けるのかという疑問がうまれました。 　リシン以外のアミノ酸のユビキチン化を報告されている文献をご存知の方が、いらっしゃいましたら情報を教えて頂きたいです。

全15件 ( 1 〜 15 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を

チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する 名前  メール  　アドレス非公開    タイトル  本文       設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます） 上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません） 解決（問題が解決した際にチェックしてください） 暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。 送信

---

〔使い方〕 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。

---