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(無題) 削除/引用 No.3137-8 - 2014/06/20 (金) 14:54:02 - ざいも >massさん、qwさん 基質が泳動されていないかどうかは私も疑問に思ったので、泳動していないゲルと、泳動したゲルをエチブロで染色して比較してみたところ、分離ゲルはほぼ同じような染まり方をしていました。 基質を入れなかったゲルでは、染まらなかったので、大丈夫だと思います。

(無題) 削除/引用 No.3137-7 - 2014/06/20 (金) 07:45:56 - おお >[Re:6] massさんは書きました : > 核酸のザイモグラフィーは経験がありませんが、通常、ザイモグラフィーは、祖抽出液中のアクティブな酵素の存在を分子量、もしくは荷電に基づいて分離後、検出するものなので、祖抽出液は、基質を含まない電気泳動で分離した後、このゲルを、基質を含むゲルに重ねて（このゲルは通常の酵素反応を行う反応溶液と同じ組成で作ります。 MMPなんかはきしつの入ったゲルの中でえいどうして、renatureさせて反応させてみますよね。なのでゲルの重ね合わせはしてない方法もあります。massさんの示す方法はどういう酵素で使われている方法でしょうか。重ねるときに酵素がきしつのあるゲルに移動しないといけないと思いますが、その辺はどうなってるんでしょうか。拡散によるものであれば分子量が高いほどふりになりますし、比活性がわかりにくくなります。 > 述べられているような方法では、泳動のされ方が酵素と基質で異なるので、酵素が分離された後、そこに十分な基質があるか、疑問ですし、すべての分子量の画分（つまり、ゲル全体に均一に）に基質となるRNAがあるか疑問です。 確かにそれは疑問点でもありますが、えいどうして染めてみれば使えるかどうかわかりますから、、、 >また、高分子量側（もしくは低移動度側）は、低分子量（もしくは高移動度）の酵素（もしあれば）も通過するので、定量的ではありません。 移動時は変性状態で流しているような気がしますので通過はあまり関係ないのではと思うのですがいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3137-6 - 2014/06/20 (金) 04:46:00 - mass 核酸のザイモグラフィーは経験がありませんが、通常、ザイモグラフィーは、祖抽出液中のアクティブな酵素の存在を分子量、もしくは荷電に基づいて分離後、検出するものなので、祖抽出液は、基質を含まない電気泳動で分離した後、このゲルを、基質を含むゲルに重ねて（このゲルは通常の酵素反応を行う反応溶液と同じ組成で作ります。）一定時間、インキュベーション後、この基質を含むほうのゲルを染色して（たとえばたんぱく質が基質ならば、基質が分解されているとその部分が抜けて見える）、酵素活性のある分画を同定します。 述べられているような方法では、泳動のされ方が酵素と基質で異なるので、酵素が分離された後、そこに十分な基質があるか、疑問ですし、すべての分子量の画分（つまり、ゲル全体に均一に）に基質となるRNAがあるか疑問です。また、高分子量側（もしくは低移動度側）は、低分子量（もしくは高移動度）の酵素（もしあれば）も通過するので、定量的ではありません。

(無題) 削除/引用 No.3137-5 - 2014/06/19 (木) 12:48:27 - ざいも ご返事ありがとうございます。 >おおさん PMSFは水に溶けないので、EtOHに溶かしてから0.1％入れています。 バンドの出る位置が濃縮ゲルと分離ゲルの境界線付近に出ることも あるので、PMSFの濃度が高くなっているだけかもしれません。 PMSFの入っているゲル、入っていないゲルでもう一度確認してみます >qwさん RNAと複合体になっていることは思いつきませんでした。 ゲルではなく、サンプルにPMSFを入れてみます。

(無題) 削除/引用 No.3137-4 - 2014/06/19 (木) 07:25:46 - qw 変な白いバンドはどの辺に出ていて、それはサンプルに由来しそうなのでしょうか？ 白いバンドを切りだして、普通のSDS-PAGEにかけてみると、どうなんでしょう？ ザイモグラフィーのつもりが、アフィニティーエレクトロフォレシスのような感じになり、RNAとヌクレアーゼの複合体の可能性はないのかな？ PMSFはプロテアーゼ阻害を考えて入れているのでしょうか？ PMSFは長持ちしないと言われているので、ゲルではなくて、サンプルに入れる方が効果的かもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3137-3 - 2014/06/19 (木) 07:19:33 - おお PMSFも溶けにくいので、えいどう中にどこかにスタックすると局所的濃度が高くなって沈殿するかもしれませんね。。。

(無題) 削除/引用 No.3137-2 - 2014/06/19 (木) 06:16:45 - おお エタノールがどれくらい入っているのでしょうか。。。0.1%ぐらいならいいかもしれませんが、多ければ蛋白を沈殿させるかもしれません。

ザイモグラフィについて 削除/引用 No.3137-1 - 2014/06/19 (木) 00:50:56 - ざいも 今研究でザイモグラフィを行っています。 ヌクレアーゼがRNAを分解するところを確認しようとしています。 ポリアクリルアミドゲル中にRNAを入れて、泳動しているのですが、 どうしても変なバンドが出てしまいます。 このバンドは肉眼でもはっきり見えるくらい、白く出ています。 ゲルに入ってるのは、アクリルアミド、Tris-HCl, SDS, RNA, PMSF, EtOH, APS, TEMEDです。 サンプルバッファーは、グリセロール、SDS, BPBです。 流しているサンプルは粗酵素液です。(Viva spinでMW10000以下は落としています) 泳動バッファーは、普通のSDS−PAGE用のバッファーを用いています。 酵素反応に使っているバッファーは、Tris-HCl, MgCl2です。 SDSは、通常のSDS-PAGEの4分の1程度です。 これらの中に白色沈殿または結晶を生じる組み合わせはありますか？ 勉強不足で申し訳ないのですが、もしご存知の方がいらっしゃいましたら、 教えてくださるとありがたいです。

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