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(無題) 削除/引用 No.3133-14 - 2014/06/19 (木) 08:39:29 - ahoka? 培養した菌にプラスミドがあるかどうかも確認してないで 「プラスミドの回収キットの方法変わりましたか？ 」 だとぉ？

(無題) 削除/引用 No.3133-13 - 2014/06/18 (水) 20:20:44 - おお 酵母増やしてるかもしれないね。

滅菌しない培地で抗生物質3種混合？ 削除/引用 No.3133-12 - 2014/06/18 (水) 17:39:41 - ~ 後出しで条件や評価していた項目を出しても誰も幸せにはなれないと思いますが、 現時点で分かっていることは他にもあるのでしょうか？ 例えば、ラボの他のメンバーが同じ株または別の株でプラスミドが取れているのかは、 装置や試薬に問題がないかどうかを示す重要な手掛かりになります。 それと、カラムでのみ回収しているようですので、バッファーがおかしくなっている可能性はまだ残っていると思います。 EndoFreeのキットがあるのでしたら、そちらのバッファーでも回収してみてはいかがでしょうか。 >抗生物質はAmp, Kana, Tetraです。 滅菌の有無よりも、こちらの方が重要な情報の気がします。 3種類も抗生物質を入れるということは、それなりに特殊な系だと思いますが、 前のラボでも同じベクター系(3種類が共存？)でプラスミド回収をしていたのでしょうか？ または、今のラボでその系の株からプラスミドを回収できたことがある人はいるのですか？ もしこれまでにプラスミドが回収されたことのない系だった場合、 ベクターのコピー数・サイズから予想される、収量はどの位になるか計算していますか？ また、ベクターのコピー数と抗生物質濃度の関係は確認されていますか？ Low copyなのに、high copy用の抗生物質濃度にしたりしていませんか？

(無題) 削除/引用 No.3133-11 - 2014/06/18 (水) 16:56:42 - 774R ミニプレップでもプラスミドが取れないなら、キットは無関係であり、菌がおかしいことが確定してわけじゃん。 そもそも、MidiとかMaxiをやる前段階で、ミニプレップで確認とかしてないの？ ちなみに、そのタブレット培地でどうだか知りませんが、過去に粉末から作る培地で、横着して電子レンジで溶かして使ったときは変な菌か酵母かなんだか分からないものが生えてきたことありますよ。 自分で培地をオートクレーブできる権限があるならやってみたほうがいい。

(無題) 削除/引用 No.3133-10 - 2014/06/18 (水) 08:01:06 - Harmonia > LB培地は上司からレンジでチンしてLBタブレットを溶解させただけのLB培地 それを疑うなら、その操作の後、菌を植えずに３７℃一晩放置。

(無題) 削除/引用 No.3133-9 - 2014/06/18 (水) 05:58:21 - テック みなさまご回答いただきありがとうございます。 P3を添加後、(P2を加えた際と同様に) 転倒混和を20回ほどしています。 カラムは確認したところ消費期限前のものでした。 すみません。キットはmidi kitとmaxi kitを両方試していました。 やはりプロトコルには特段疑う点はなさそうですね… カラムを使ったmini prep後のエタチンでは確かにペレットが見えるんですが、TEに溶解後、ゲルで泳動するとなぜだか見えないんです。マーカーも見えるのでエチブロが入っていないわけではないです… また、TE溶解するとゲル状もものが見えたのでてっきりゲノムかと疑ってしまいました。 LB培地は上司からレンジでチンしてLBタブレットを溶解させただけのLB培地を使っています。 本当はオートクレーブでしっかりと滅菌したものを使うべきですよね？ 何か変なものが増えているとしか考えられないです…抗生物質はAmp, Kana, Tetraです。

(無題) 削除/引用 No.3133-8 - 2014/06/18 (水) 03:26:11 - おお そもそもDEAEのようなカラムでそう簡単にゲノムが落ちてくるかな。。。 菌体が回収時期にはすでに弱っているのではないかとおもったりするが、、、

(無題) 削除/引用 No.3133-7 - 2014/06/17 (火) 17:24:29 - ＴＴ 大して変わらないじゃん

(無題) 削除/引用 No.3133-6 - 2014/06/17 (火) 17:02:07 - 774R 新旧どちらのプロトコルでもちゃんとプラスミドは取れますので、プロトコルは収量の悪化から除外していいでしょうね。 よくあるのが、プラスミドのコピー数が少ないために収量が少なくなるパターン。ミニプレップスケールの培養だと普通に精製できるのに、スケールアップをするとコピー数がガタ落ちする例もあります。 一度、キットで精製する大腸菌とまったく同じものを使って、ミニプレップでプラスミド量を確認することをお勧めします。 なお、P3を冷やしたり、添加後に冷やしたりというのは、あまり本質的な部分ではありませんから、気にする必要はないでしょう。

(無題) 削除/引用 No.3133-5 - 2014/06/17 (火) 16:52:31 - 小言幸兵衛 midiなんですか、maxiなんですか？

(無題) 削除/引用 No.3133-4 - 2014/06/17 (火) 15:57:45 - ~ 今のマニュアルは2011年1月版のようですので、変わったとすればそのタイミングかさらに前ですね。 同じ名前のままでカラムの素材やバッファー組成を大きく変えることはないと思いますので、 収率悪化の原因はプロトコルではないと思うのですが…

(無題) 削除/引用 No.3133-3 - 2014/06/17 (火) 15:45:43 - み 本質かどうかわかりませんが、気になる点： P3を加えたあともgently invert several timesじゃなかったですか？

(無題) 削除/引用 No.3133-2 - 2014/06/17 (火) 12:49:48 - mon 通常のMidi-kitとENDO-free kitでは、bufferが異なったと思いますよ。 たしかEndotoxinを洗浄するため、P3加えて遠心・濾過して清浄化した後、1/10ほどある溶液を加えて冷やしたと思います。また、溶出液も異なっていた（ENDO-freeの方が塩濃度が高い）と思います。 Manualを比較してください。 あと、カラムが古くなる(劣化？）と収量が激減するもの(すべてではない）があった記憶があります。

プラスミドの回収キットの方法変わりましたか？ 削除/引用 No.3133-1 - 2014/06/17 (火) 12:14:28 - テック こんにちは。 現在キアゲンのDNA midiprepキットを使ってプラスミドの精製をしています。 お尋ねしたいことは標題にあるように精製のプロトコルが変わっていますか？ということです。 ここ数回200 mlほどのLB液体培地からプラスミドを精製しようとしていますが、毎回収率が悪かったりゲノムが取れて来たりと失敗続きます。これまではプラスミドはルーチンに取っていましたが、別の研究室に変わり、突然できなくなりました。 使用しているキットはキアゲンのもので、P1, P2, P3, QBT, QC, QF バッファーなどを用いて精製しています。 失敗が続き改めてキットに添付されているプロトコルを確認しましたところ、以前のプロトコルと随分変わっていることに気付きました。 これまでの方法を以下に示します。 1. 大腸菌を回収、デカント 2. cold P1（RNase入り）を加えて、voltex well 3. 速やかに常温P2を等量加え、gently invert well (少なくとも転倒混和を20回ほど), RT 5 min静置 4. 常温P3をP1, P2と等量加えて、すぐにon ice 15 min 5. 遠心, 30 min 6. カラムを予めQBTで平衡化したものに、上清をアプライ 7. QCで洗浄 8. QFで溶出 9. イソプロ沈 10. エタチン沈 11. TEで再溶解 ですが、別のラボに来て同じようなパッケージのキアゲンのキット（EndoFree® Plasmid Maxi Kit）を使って上記プロトコルでは精製に失敗しました。 そのキットのプロトコルでは異なる点が多く驚いています。 まず、P3はcoldのものを使用せよと書かれてありますし、また、P3添加後には氷上incubationはしないと書かれてあります。 なぜ方法が変わってしまったのでしょうか？ご存知の方いらっしゃいますでしょうか？

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