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(無題) 削除/引用 No.3124-14 - 2014/06/12 (木) 09:04:14 - 城戸 おおさん 度々ご指摘ありがとうございました。 再考してみます。

(無題) 削除/引用 No.3124-13 - 2014/06/11 (水) 23:56:09 - おお エチブロなどで見えるほどPCRで増幅した場合には、増幅効率が飽和してさが見れなくなっているということもあってqPCRが考案されて現在よく使われている手法になっています。電気えいどうで差があればおそらく発現の差はいえるのではと思いますが、なかったとき本当にないのかという点で疑問符がつくかもしれません。 qPCRを行うか、PCRのサイクル数を減らしてエチブロで見えないぐらいにして、PCR-southernで検出という手も取れるかもしれません。RIが比較的コストがかからない海外ではP32でラベル(P32-dCTPなどを取り込ませる)をつかうラボもあるようです。 またRNAレベルで3、4倍で蛋白量で10倍以上ということもあるのですが、こういう場合はあまり突っ込まない人が多いとおもいますが、post-transcriptionalも関与している可能性はあります。

(無題) 削除/引用 No.3124-12 - 2014/06/11 (水) 20:16:58 - 城戸 そうだと思います。 なので、比較してという話は組織どうしでしています。

(無題) 削除/引用 No.3124-11 - 2014/06/11 (水) 20:09:33 - み >[Re:8] 城戸さんは書きました : > > ポジコンと比較して、mRNAの量は同じくらい多く検出できますが、タンパクの発現は認められませんでした。 ポジコンとは何ですか？培養細胞とかですか？ 仮に培養細胞と組織との比較と仮定して、蛋白を抽出した場合、同じ蛋白量を電気泳動にアプライしても組織由来の方が検出しにくくなるでしょう。 組織の方は細胞外蛋白や血液の混入などによる細胞以外の蛋白の持ち込みがあるので、、、

(無題) 削除/引用 No.3124-10 - 2014/06/11 (水) 14:41:01 - 城戸 返信ありがとうございます。 電気泳動法によるものです。 確実な定量性はないですが、目安にはなると考えています。

(無題) 削除/引用 No.3124-9 - 2014/06/11 (水) 14:30:57 - おお RTPCRの定量はqPCRでしょうか?

(無題) 削除/引用 No.3124-8 - 2014/06/11 (水) 13:34:31 - 城戸 皆様、たくさんの知見をありがとうございます。 翻訳阻害等、多方面に原因が考えられるようで、別の視点からの実験が必要のようですね。 知識不足の私にとって大変ためになります。 ポジコンと比較して、mRNAの量は同じくらい多く検出できますが、タンパクの発現は認められませんでした。（回答になっていますでしょうか）

(無題) 削除/引用 No.3124-7 - 2014/06/11 (水) 13:21:53 - おお WBのポジコンが組織や細胞ならばそこから取れたRNAのRTPCRで今回検出しているサンプルでポジこんに対してどれぐらいの発現量か検討つくと思うのですが、結果はどんな感じでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3124-6 - 2014/06/11 (水) 12:52:17 - おお あ、くわえて、RT-PCRなので検出できても蛋白が十分合成されるほどの量ではない可能性も考えてもいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3124-5 - 2014/06/11 (水) 12:49:49 - おお 同じような質問が前にあったので、すでに回答してるかと思ったら、、、 monさんがほとんどカバーしてますね。総じてpost-transcriptional regulationと一言で片付けれるかもしれません。最近ではtranscriptionは起こっているがそのproductsであるpre-mRNAが核に蓄積していて、刺激が起こったときなど必要なときにsplicingがおこって蛋白が発現するというメカニズムも報告があります。

(無題) 削除/引用 No.3124-4 - 2014/06/11 (水) 12:45:03 - ~ 翻訳阻害が起きている タンパク質の分解が特別に早い WBのポジコンよりも十分にタンパク質量が低く、検出限界以下である RT-PCRで増えていたのはシュードジーンで、増幅させた部分の配列は目的遺伝子と一致しているがタンパク質にはならない

(無題) 削除/引用 No.3124-3 - 2014/06/11 (水) 12:42:36 - mon (1)WBの感度が低い。 (2)タンパクの安定性が低い（積極的に分解されているものもある。ある種のシグナルで安定性が向上など）。 (3)翻訳が（特異的に）停止されている。あるいは（mRNAの高次構造などで）非常に翻訳効率が悪い。 (4)RT-PCRが全長を増幅しているのでなければ、mRNAが部分的に分解されているとか、altanative splicingなどで抗体が認識する部位の無いタンパクが産生されている。 (5)抗体が認識する部位の無いタンパクに切断されている。抗体が認識する部位が修飾され、抗体が結合できない。 まだまだありそう...

(無題) 削除/引用 No.3124-2 - 2014/06/11 (水) 12:41:14 - Harmonia RT-PCRもWestern blotも、生成と分解の結果の蓄積量を見ている。 生成されなければ見えないし、生成されても同じだけ分解されれば見えない。

mRNAとタンパクの発現 削除/引用 No.3124-1 - 2014/06/11 (水) 12:02:02 - 城戸 スペースお借りします。 ある組織において、ある分子のmRNAの発現をRT-PCRによって確認できているにも関わらず、Western blot(WB)においてタンパクの発現がnullの場合どのような原因、機序が考えられるでしょうか。 RT-PCR、WBともにポジコンで実験と抗体の正しさは確認しています。 見解をお持ちの方、ご教授ください。

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