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(無題) 削除/引用 No.3118-20 - 2014/06/11 (水) 08:41:48 - papa >8個制限酵素消化して電気泳動したのちに得られるDNAバンドには，主に2種類のバンドがみられるのでしょうか？ 上の意味は，1レーンに主に2つのバンドの意味ではなく，1〜8レーンあったときに，レーン1では2 kb，レーン2では3 kb，レーン3では2 kb，レーン4では3 kbというような意味です。

(無題) 削除/引用 No.3118-19 - 2014/06/11 (水) 08:38:53 - papa ベクターそのものはベクター＋インサートの長さになっているのでしょうか？（これは制限酵素一箇所で切断して電気泳動して調べないといけない） 切れていないという判断は，制限酵素消化後インサートのバンドが見えないということで判断したのでしょうか？ 8個制限酵素消化して電気泳動したのちに得られるDNAバンドには，主に2種類のバンドがみられるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3118-18 - 2014/06/10 (火) 23:06:37 - おお >[Re:16] みむさんは書きました : > >[Re:13] おおさんは書きました : > > > > CIAPなどのligation時の持ち込みはあるかもしれませんので、 > > PCR後の精製、および制限酵素、CIAP処理後の精製は、ゲルに通して電気泳動を行った後、カラムキットを用いて精製しております。 > CIAPのユニット数を少し減らして、処理時間を30分程度の短い時間にしてやってみたいと思います。 > また、よろしくお願い致します。 カラムキットを使っているなら、除蛋白はできていると思いますので、CIAPは過剰に使っていないなら減らす必要はないです。バックグランドが300なのでCIAPがちょっときいてないかなあという印象もありますので。 切り出しの時のUVによるダメージはしばしここで議論になります。銀紙で覆ってレーンの端だけUVを当てて切り出すとかの工夫をすることでダメージが防げます。

(無題) 削除/引用 No.3118-17 - 2014/06/10 (火) 21:33:43 - ｃDNA バックグランドが100として、そこで得られるのはセルフのはずだから、BamHIで切れるのでしょうか？やってないとは思いますけど、切れないんじゃないですかね。 そういう場合にはCIAPに誰かが何かを混ぜてしまったとか、外からは分からない問題だったりするので、全部の試薬を一新するのも手なのですが、いっそのこと操作を減らしたらどうですか？ 脱リン酸化しない、電気泳動しない（あくまでPCR増幅がきれいだったとして）、制限酵素処理後はキットでの精製のみ。ライゲーションも室温10分とか。 ベクターとインサートを濃いめにして反応させると8個も拾えば欲しいものが取れそうです。

(無題) 削除/引用 No.3118-16 - 2014/06/10 (火) 17:29:20 - みむ みなさま、ご回答誠にありがとございます。 >[Re:15] ~さんは書きました : > ミニプレップしたプラスミドが制限酵素処理1回で全量使われている点に疑問がありますが… > > APさんが書かれているPCR産物のfill-inについては、 > > ・PCR産物にはどのような処理を行ったのでしょうか？ > で行った処理をきちんと答えていれば、問題がありそうかまでコメントを貰えていたと思います。 >[Re:13] おおさんは書きました : > > CIAPなどのligation時の持ち込みはあるかもしれませんので、そういう酵素をしっかり除けるよう処理をすることは大事かと思います。BamHI もかなりしつこいと言う人はいますね。PCR productsは切断後何らかの精製をしてますか? PCR後の精製、および制限酵素、CIAP処理後の精製は、ゲルに通して電気泳動を行った後、カラムキットを用いて精製しております。 CIAPのユニット数を少し減らして、処理時間を30分程度の短い時間にしてやってみたいと思います。 また、よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3118-15 - 2014/06/10 (火) 09:34:44 - ~ ミニプレップしたプラスミドが制限酵素処理1回で全量使われている点に疑問がありますが… APさんが書かれているPCR産物のfill-inについては、 > ・PCR産物にはどのような処理を行ったのでしょうか？ で行った処理をきちんと答えていれば、問題がありそうかまでコメントを貰えていたと思います。 すでにミニプレップ中と思いますので、まずはインサートがあるかないかを確認した上で、 次の対策を考えてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3118-14 - 2014/06/10 (火) 01:06:06 - おお >バックグランドが100でライげーしょんしたら300ってうのは少ないと思います。どこかあまりワークしてないところがあるように思います。 理論的に200はポジだろうという理屈はありますが、なにかうまくワークしてないためそういう風にはなってないだろうという感触です。

(無題) 削除/引用 No.3118-13 - 2014/06/09 (月) 23:26:11 - おお バックグランドが100でライげーしょんしたら300ってうのは少ないと思います。どこかあまりワークしてないところがあるように思います。ただ難しいばあいはそう言うこともあり得るので、まだligation用に用意したベクターがあるなら、1/30の量をligationしてtransformationしてみてもいいかもしれないです。私はそうしてバックグランドが少ない状態でtransformationするようにしています。 BamHIで切れないのはCIAP処理などのためつながりにくくなったベクターが大腸菌のなかで削られたりしてあとにつながったものなど見ているのだと思います。 あとBamHIはワークしているようなので、切れてないプラスミドはBamHIを持ってないでしょうね。insertらしきものがほかの制限酵素で見つかったとしても使えるプラスミドじゃない可能性が高いのではないですか? CIAPなどのligation時の持ち込みはあるかもしれませんので、そういう酵素をしっかり除けるよう処理をすることは大事かと思います。BamHI もかなりしつこいと言う人はいますね。PCR productsは切断後何らかの精製をしてますか?

(無題) 削除/引用 No.3118-12 - 2014/06/09 (月) 19:34:54 - AP アルカリフォスファターゼ処理のことなんか言ってないよ。 プラスミド精製過程のアルカリ処理（アルカリ／SDS処理）のこと。 polymeraseのなかにexonuclease活性を持っているものもあるが、exoは必ずpolかというとそうではない（そうではないほうがむしろ多数派ではないか？）。例えばexoIIIなんかはラボで使うこともあるんじゃないか。 もちろん、ある種のポリメラーゼがコンタミするとexonuclease活性で末端が削れるという可能性はある。例えば、末端平滑化処理のために入れたKlenowやT4 DNA polも条件が悪いと、かえって末端から削りこみが起こって平滑化に失敗することがある。 PCR産物のクローニングの場合、PCR反応の後の処理を適切に行わないと、残存するポリメラーゼ活性とdNTPによって制限酵素消化末端が平滑化（削りこみというより、fill-inで）されて、blunt-end ligationになってしまう可能性もある。こうなるともとの制限酵素で切れなくなる。

(無題) 削除/引用 No.3118-10 - 2014/06/09 (月) 18:58:33 - 774 アルカリ処理過剰の件は、mini-prepの過程のアルカリ処理でしょう。 アルカリフォルファターゼ処理ではなく。

(無題) 削除/引用 No.3118-9 - 2014/06/09 (月) 18:47:06 - papa 切れないと判断した根拠が知りたいです。

(無題) 削除/引用 No.3118-8 - 2014/06/09 (月) 18:38:45 - みむ >[Re:7] ~さんは書きました : > 300個中100個が繋がり方は何であれセルフですよね。 > 何個調べてのかが書かれていませんが、確率的に残りの200/300を拾えているだろうという数を見ているのでしょうか？ > 調べたのが１〜２個だと、単にはずれを引いたのかもしれません。 8個拾いました。 > それはともかく、まずはベクターまたはインサートで1カットできる制限酵素で処理して、インサートが入っているかどうかを確認されてはいかがでしょうか。 > 15分もあれば切れるでしょうから、今日中に結果が分かりますよね。 やってみようと思います。ただ、プラスミドは制限酵素処理にすべて使ってしまったので、もう一度ミニプレップを行いたいと思います。ありがとうございます。 >[Re:6] APさんは書きました : > ちょっと確認してほしいのはBamH1で切れないだけなのか、ほかの制限酵素でも切れないのか。 その場合分けもやっていなかったです。やってみたいと思います。 > 前者なら制限酵素認識配列が崩れているのだろう。exonucleaseなどで末端が削れたもの同士がligationしたとか。 ひとつご質問なのですが、今回は8個コロニーをつついて8個とも切れないという状況でした。そのような高確率でexonuclease活性により末端が削れることや、認識配列が崩れることはあるのでしょうか？また、exonuclease活性はDNAポリメラーゼのもつ活性という認識でいたのですが、DNApolとは別に単独でベクターに働きかけるといったことはあるのでしょうか？ また、認識配列が崩れるメカニズムとして他にどういったものが知られているのでしょうか？ご教示頂ければ幸いでございます。 > 後者なら、プラスミド精製の過程に問題があるのではないか。アルカリ処理過剰でプラスミドが部分変性しているとか（こうなるといかなる制限酵素でも切断できなくなる）。 今回は、60μLのスケールで30 UnitのCIAPを用いて、60分間処理しました。アルカリ処理過剰とは、時間的に過剰ということなのか、CIAPの量が過剰ということなのか、ご教示頂けないでしょうか？また、プラスミドが変性するほどのアルカリ処理の条件についてもしご存じでいらっしゃいましたら、ご教示頂けないでしょうか。 質問が多くて申し訳ございません。よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3118-7 - 2014/06/09 (月) 17:46:30 - ~ 300個中100個が繋がり方は何であれセルフですよね。 何個調べてのかが書かれていませんが、確率的に残りの200/300を拾えているだろうという数を見ているのでしょうか？ 調べたのが１〜２個だと、単にはずれを引いたのかもしれません。 それはともかく、まずはベクターまたはインサートで1カットできる制限酵素で処理して、インサートが入っているかどうかを確認されてはいかがでしょうか。 15分もあれば切れるでしょうから、今日中に結果が分かりますよね。 その結果からインサートが入っていないことが分かれば、今日中にそれなりの数のコロニーを拾って振って帰り、明日は数で勝負できるでしょう。 インサートが入っていることが分かれば、すぐの対応は難しいかもしれません。配列解析の準備を考えてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3118-6 - 2014/06/09 (月) 17:38:01 - AP ご存知と思うが、BamH1に切断に影響するメチル化はないのでその可能性はなし。 ちょっと確認してほしいのはBamH1で切れないだけなのか、ほかの制限酵素でも切れないのか。 前者なら制限酵素認識配列が崩れているのだろう。exonucleaseなどで末端が削れたもの同士がligationしたとか。 後者なら、プラスミド精製の過程に問題があるのではないか。アルカリ処理過剰でプラスミドが部分変性しているとか（こうなるといかなる制限酵素でも切断できなくなる）。

(無題) 削除/引用 No.3118-5 - 2014/06/09 (月) 17:25:36 - みむ みなさま、ご回答誠にありがとうございます。 >[Re:4] ~さんは書きました : > ・BamHI認識配列の外に何塩基余分な配列を付けたプライマーなのでしょうか？ 3塩基分です。 > ・PCR産物にはどのような処理を行ったのでしょうか？ ベクターと同じようにBamHIで処理しました。 > ・ベクターにはアルカリフォスファターゼ処理を行いましたか？ 行いました。 > ・ベクター側で1カットできる制限酵素で切った場合には、ベクター＋インサートのサイズのバンドが得られるのでしょうか？ それはやっていなかったです。 > ・インサートなしでベクターのみをライゲーションした場合はどのような結果になりますか？ ベクターのみをライゲーションしたものを大腸菌に入れたものが100個コロニーができるとしたら、インサート入りのものを大腸菌に入れたものは300個くらいコロニーができます。ノンスぺが多いというのが現状です。 > > 書かれている結果から考えると、 > ・プライマーのBamHIサイトの外に付加配列を付けていなかったため、PCR産物にBamHIの末端がない > だけではトラブルが説明できません。 > > ・少し削れたベクターがセルフライゲーションしたものが取れている > だと一応は辻褄が合うのですが。 >[Re:3] papaさんは書きました : > 切れないとの判断はどのようにしているのでしょうか？ > 産物が汚いとか。 空ベクターを入れた大腸菌から同じようにプラスミドを精製して、同じようにBamHI処理をしたのですが、空ベクターの方はちゃんと切れていた、ということから判断しました。 >[Re:2] ほしさんは書きました : > BglIIサイトにライゲーションすると切れなくなります。 > まずはシーケンスしてみてはどうですか？ ベクターのBamHIサイトにライゲーションしております。 よろしくお願い致します。

(無題) 削除/引用 No.3118-4 - 2014/06/09 (月) 17:12:35 - ~ ・BamHI認識配列の外に何塩基余分な配列を付けたプライマーなのでしょうか？ ・PCR産物にはどのような処理を行ったのでしょうか？ ・ベクターにはアルカリフォスファターゼ処理を行いましたか？ ・ベクター側で1カットできる制限酵素で切った場合には、ベクター＋インサートのサイズのバンドが得られるのでしょうか？ ・インサートなしでベクターのみをライゲーションした場合はどのような結果になりますか？ 書かれている結果から考えると、 ・プライマーのBamHIサイトの外に付加配列を付けていなかったため、PCR産物にBamHIの末端がない だけではトラブルが説明できません。 ・少し削れたベクターがセルフライゲーションしたものが取れている だと一応は辻褄が合うのですが。

(無題) 削除/引用 No.3118-3 - 2014/06/09 (月) 17:11:30 - papa 切れないとの判断はどのようにしているのでしょうか？ 産物が汚いとか。

(無題) 削除/引用 No.3118-2 - 2014/06/09 (月) 16:47:12 - ほし BglIIサイトにライゲーションすると切れなくなります。 まずはシーケンスしてみてはどうですか？

BamHIで切れない 削除/引用 No.3118-1 - 2014/06/09 (月) 16:23:51 - みむ いつもお世話になっております。 Fw,RvともにBamHIサイトをもつプライマーであるDNA領域を増幅後、それをインサートとして、BamHIで切断したベクターに挿入してライゲーションを行いました。しかし、ミニプレップ後の産物をBamHIで切断しても全く切れません。コントロールの空ベクターはちゃんと切断できているのですが。。。BamHIサイトがメチル化されうることとか、他に何か原因として挙げられるものがございましたら、ご教示頂けないでしょうか。 みなさまのご意見よろしくお願い致します。

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