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脂肪酸の保存について トピック削除
No.3117-TOPIC - 2014/06/09 (月) 12:49:42 - そら
いつも参考にさせていただいています。
現在、購入した標準品の脂肪酸を培養細胞に添加する実験を行っております。
脂肪酸の調整は以下の様に行っています。

標準品 (エタノールにとけている液状 Cayman など)を20 %BSA (FFA free 低エンドトキシン)にて終濃度10mMになるように調整。これを1回の添加でつかう量に小分けして、スクリューキャップの遮光のバイアル(1.5mlほどの容量)に入れて窒素バージをして-20℃にて保存。

脂肪酸の保存における安定性などについて、以下の点につきコメントいただけましたら幸いです。

1Caymanの添付文書によると、溶解後は12時間以内に使用するように、となっています。実験の度ごとに標準品から溶解して準備するのも手間なので、以前このフォーラムででていたトピックスを参考に上記の様に行っています。やはり購入した標準品のバイアルから1回1回調整するほうが良いのでしょうか。
2保存した脂肪酸を細胞実験に用いた場合に起こりうる問題点は、具体的にはなにでしょうか。
保存することによる、脂肪酸の劣化による効果半減? 脂肪酸の酸化による細胞障害?

どうぞよろしくお願いいたします。
 
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(無題) 削除/引用
No.3117-5 - 2014/06/10 (火) 15:07:39 - AP
長鎖多価不飽和脂肪酸かあ。
教科書的には、脂質の酸化によって脂質過酸化反応からのラジカル発生で細胞障害が起こるシチュエーションですなあ。溶解後12時間で云々はそれを避けるためでしょうね。

(無題) 削除/引用
No.3117-4 - 2014/06/10 (火) 09:37:15 - ~
たしか、42 mg/L in EtOHです。
もしかしたらもう1桁濃度が高かったかもしれません。

濃度から何をやったかお分かりかもしれませんが、
リノール酸は大して重要な位置付けではありませんでした。

ありがとうございます。 削除/引用
No.3117-3 - 2014/06/09 (月) 22:20:24 - そら
ありがとうございます。
アウトプット次第、ということですね。確かに系が安定していれば良いわけですし、添加の濃度がどの程度か、ということになります。
添加する脂肪酸は、長鎖不飽和脂肪酸 (リノール酸、リノレン酸、アラキドン酸、ドコサヘキサエン酸など)です。
リノール酸を、窒素バージなしで使用して、結果に問題なかったということはとても参考になりました。もし差し支えなければ保存時の濃度を教えていただけますでしょうか。

(無題) 削除/引用
No.3117-2 - 2014/06/09 (月) 16:49:09 - ~
使用する脂肪酸の性質と行う試験次第でしょう。
前にリノール酸を培地に添加していた時は、窒素パージもせずに1本のチューブを数週間に渡って使っていましたが、アウトプットに変化は見られませんでした。
事前に10倍の濃度範囲で影響が見られないことを確認した上での話ですが。


一般化した質問をしても、そらさんが行おうとしている実験の結果に影響がないかどうかは誰もコメントできないと思います。

1 1回ごとにアンプルを切れば、開封後の時間経過の影響を最小限にできるでしょう。
ただし、その手間がコストと労力に見合うかは別途評価が必要でしょう。
逆に、未開封のアンプルだからと言って、秤量範囲や分解で有効成分の量や純度が違う場合があるかもしれません。その場合は、同じアンプルで実験した方が安定するかもしれません。

2 その脂肪酸の性質と細胞実験の系次第でしょう。そらさんの系で、脂肪酸量が十分なのかボトルネックなのかが分かりません。後者の場合は、分解されればその分の影響が生じるでしょうけれども、分析や培養のバラつきで消えるか残るかは系全体でみる必要があるでしょう。
また、脂肪酸酸化物等について、細胞による高感度検出系の存在を否定することはできません。

脂肪酸の保存について 削除/引用
No.3117-1 - 2014/06/09 (月) 12:49:42 - そら
いつも参考にさせていただいています。
現在、購入した標準品の脂肪酸を培養細胞に添加する実験を行っております。
脂肪酸の調整は以下の様に行っています。

標準品 (エタノールにとけている液状 Cayman など)を20 %BSA (FFA free 低エンドトキシン)にて終濃度10mMになるように調整。これを1回の添加でつかう量に小分けして、スクリューキャップの遮光のバイアル(1.5mlほどの容量)に入れて窒素バージをして-20℃にて保存。

脂肪酸の保存における安定性などについて、以下の点につきコメントいただけましたら幸いです。

1Caymanの添付文書によると、溶解後は12時間以内に使用するように、となっています。実験の度ごとに標準品から溶解して準備するのも手間なので、以前このフォーラムででていたトピックスを参考に上記の様に行っています。やはり購入した標準品のバイアルから1回1回調整するほうが良いのでしょうか。
2保存した脂肪酸を細胞実験に用いた場合に起こりうる問題点は、具体的にはなにでしょうか。
保存することによる、脂肪酸の劣化による効果半減? 脂肪酸の酸化による細胞障害?

どうぞよろしくお願いいたします。

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