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(無題) 削除/引用 No.3115-13 - 2014/06/15 (日) 16:02:17 - ぺーぺー なんか、gain of functionの実験とかでなんとかならないものなのかと思いました。 実験系の詳細が分からないのでなんとも言えませんが。 同時に２つのパラメータが動く実験系ひとつで決定的なことを言うのは難しいと思います。 阻害剤やらgain of function実験やらで状況証拠を積み重ねるのも方法かもしれませんよ。

(無題) 削除/引用 No.3115-12 - 2014/06/14 (土) 22:25:11 - 素人ですが何か。 3つの可能性があると思います。 1.JNK蛋白質の量が増えて、JNL蛋白質のリン酸化も亢進した。 2.JNK蛋白質の量が増えて、JNK蛋白質のリン酸化は変化していない。つまりJNK蛋白質全分子あたりのリン酸化JNK蛋白質の割合は変わらない。JNK総量が増えたのでそれに応じてリン酸化JNKのシグナルも増えて見えているだけ。 3. リン酸化JNK特異抗体が実際にはリン酸化されていないJNKも認識してしまっている。（リン酸がくっついているこころ以外は基本的に同じなので, 特異性によっては可能性ある。以前、その方面のプロの方から、特異性の面で確実に信頼に足るすぐれたリン酸化蛋白質抗体はあまり多くないという話を聞きました。） 1~2についてはリン酸化JNLのシグナル強度を全JNKのシグナル強度で割り算してみて、その値で見ても増加が見られるならば、1の可能性が、また増加が見られないならば2の可能性があるように思います。（シグナル強度がサチュレーションしてると意味ないので、それぞれのウェスタンは、予備実験でドーズ振って検量線描いて定量性のある範囲でやって。） 3.については情報収集して、すでに一定の評価の高いものを使うしかないかもしれない。 その他JNK抗体でIPしてそれを抗JNK抗体でウェスタンするという方法もある。通常IPで捕まえて来れるのは細胞内の抗原分子の一部だし、たとえJNKが増加していてもIPで捕まえてきたJNKは等量なので、JNKあたりのリン酸化JNKの割合を比較出来る。

(無題) 削除/引用 No.3115-11 - 2014/06/13 (金) 22:48:00 - ぼん 遅くなり申し訳ありません。 おおさん 承知しました。では、やはりタンパク定量で合わせ、actinなどで確認し、示すということにいたします。 ぺーぺーさん お返事ありがとうございます。見る限り「刺激なし」と「刺激後」でtotal JNKには明確な差はなさそうです。おっしゃる通りかもしれません。 ただ、タイムコースに関してはやはり調べた方が良いとも思いますので、検討してみます。ありがとうございました。

(無題) 削除/引用 No.3115-10 - 2014/06/12 (木) 07:38:48 - ぺーぺー 刺激を行っていない対照はあるのでしょうか？ もし、無刺激と刺激後でtotal jnkに差があれば、刺激に対する発現制御機構の感受性かもしれないので、刺激時間を短くするのは適切だと思います。 もし、無刺激と刺激後でtotal jnkに差がなければ、これはどうしようもないと思うので、p-jnk/total jnkで計算するしかないのでは。

(無題) 削除/引用 No.3115-9 - 2014/06/10 (火) 15:46:19 - おお >[Re:8] ぼんさんは書きました : > おおさん、monさん > > レスありがとうございます。大変勉強になります。 > 是非タイムコースは見てみたいと思います。 > > おおさんが仰るように、細胞数でそろえるべきところを、やっておりませんでした。今後は気を付けたいと思います。 わかりやすいように一定細胞数あたりと表現しただけで、プラクティカルには一定蛋白量、またはactinなどのinternal controlを使って比較というのが現実的だと思います。

(無題) 削除/引用 No.3115-8 - 2014/06/10 (火) 15:16:12 - ぼん おおさん、monさん レスありがとうございます。大変勉強になります。 是非タイムコースは見てみたいと思います。 おおさんが仰るように、細胞数でそろえるべきところを、やっておりませんでした。今後は気を付けたいと思います。 actinで差がなくても、ローディングしたタンパク量が完全に均一ではないかもしれないので、ノックダウン群が薄くなるようにローディングし直して、ブロッティングしてみたのですが、やはり同じような結果が得られました。 論文を見る限り、total JNKをnormalizeのためのコントロールのように扱っているものが多く、サンプル間でそろっているべきと思っており、不安があったために投稿したのですが、皆様のご意見はすごく参考になりました。 kinaseですので、actinなどとは同じではないということですね。monさんがおっしゃるように、この分子のノックダウンがJNKタンパクそのもの発現をregulateしている可能性も考えて検討していこうと思います。 また、下流やタイムコースでの評価を行っていこうと思います。

(無題) 削除/引用 No.3115-7 - 2014/06/10 (火) 00:50:09 - おお >[Re:4] おおさんは書きました : > 一定総蛋白量(厳密には一定細胞数)での比較でリン酸化フォームが多いならば、JNKのシグナルは活性化しているわけで、 特に下流ということで、上流は場合、見方によると思います。

(無題) 削除/引用 No.3115-6 - 2014/06/10 (火) 00:35:55 - おお JNKの下流の挙動もきになりますね。JNKでリン酸化されるものとか、それによってあなたの実験で期待されている細胞の振る舞いとか。

(無題) 削除/引用 No.3115-5 - 2014/06/09 (月) 12:42:09 - mon あるタンパクのリン酸化が亢進すると、そのリン酸化タンパクを減らすシグナルも活性化されることが多いと思います。リン酸化タンパクを減らすシグナルには、脱リン酸化と特異的タンパク分解系があります。 スゴく「単純に」考えると、ある分子のノックダウンで、JNKの合成(タンパク発現？）・安定性？が亢進しただけでなく、分解系が弱くなっている仮説も成り立ちますね。 おおさんも指摘していますが、刺激後8時間がピークか否か不明ですのでタイムコースはみておくべきでしょう。 合成か分解かはplus label/chase実験でわかるでしょう（＞言うのは楽だけど）。RI使わない方法があったような？

(無題) 削除/引用 No.3115-4 - 2014/06/09 (月) 11:38:55 - おお コメントを送ったような気がしたけど、、、送信し忘れたかも、、、 一定総蛋白量(厳密には一定細胞数)での比較でリン酸化フォームが多いならば、JNKのシグナルは活性化しているわけで、非リン酸化フォーム、またはトータルのJNKの量が下がろうとも、上がろうとも関係ないのではないでしょうか? トータルでJNKが上がっているのはいろいろ考えられるとおもいます。 想像ですがポジティブフィードバックとか、タンパク質の総量をあげることで細胞内のJNKリン酸化活性が上がらない状態で、JNKのシグナル伝達を増強するとか。 こういうkinaseは刺激後すぐに立ち上がることもあるので、タイムコースは見ておいた方がいいかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3115-3 - 2014/06/09 (月) 11:27:08 - ぼん Harmoniaさん レスありがとうございます。 タンパク定量でサンプル濃度を合わせ、少なくともactinはそろっているように思われます。その上でトータルJNKを認識する抗体を使って評価しているのですが、バンド上しっかり認識できる差があります。リン酸化JNK標識抗体でも差があるので、活性化状態に差があると思うのですが、この場合、リン酸化だけでなく、トータルのタンパク量としてJNKが増えている可能性を考えている次第です。シンプルに考えすぎと自分でも思いますが、どのような点に注意すればよいのでしょうか？ 不勉強で、またあまり周囲に慣れた者がいないので、基本的なところを理解していないと思います。申し訳ありませんがご教授いただければと思います。 よろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3115-2 - 2014/06/08 (日) 17:46:57 - Harmonia > WBをしたところ、リン酸化JNKがノックダウン群で非常に濃いバンドが出ま > した。ただ、トータルのJNKについてもある程度濃いバンドが出ております。 > この場合、JNK経路活性化の可能性があると考えてよいのでしょうか？ は、議論の対象になりえるけど、 > 8時間というのはトータルのJNKがタンパク量として上昇してもよいタイミ > ングなのでしょうか？ っていうのは、なんにも言えない。 まずは、どうなればタンパク質量が増えたと言えるのか、どうなればJNK経路 が活性化されたと言えるのか、実験を考えてみるところから始めるのでしょ うね。

JNK経路の活性化 削除/引用 No.3115-1 - 2014/06/08 (日) 14:48:07 - ぼん 駆け出し研究者です。 WBでの評価についてあまり慣れていないもので質問させてください。 大腸がん細胞株（SW480）である分子のノックダウンしたものに、刺激を加えた後の、JNK経路の活性化有無について検討しております。 アポトーシスの評価も同時に行っていたため、今回は非常に中途半端な時間がら、刺激後8時間に細胞を上清と合わせて回収しました。 WBをしたところ、リン酸化JNKがノックダウン群で非常に濃いバンドが出ました。ただ、トータルのJNKについてもある程度濃いバンドが出ております。 この場合、JNK経路活性化の可能性があると考えてよいのでしょうか？ 8時間というのはトータルのJNKがタンパク量として上昇してもよいタイミングなのでしょうか？ 今後、より短いタイムコースでの再検と下流のc-Jun, phospho-c-Junなどは見る予定ですが、現時点での可能性についてお聞きできれば、と思っております。 まだまだ慣れないもので、教えていただければありがたいです。 よろしくお願いいたします。

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