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(無題) 削除/引用 No.3107-11 - 2014/06/07 (土) 05:17:39 - somacho >純度さん 貴重な意見をありがとうございます。 ちょっと、蛋白質の純度を検討してみようと思います。 目的蛋白質のアミノ酸配列をモチーフ検索にかけたところ、本蛋白質がRNaseであるとは推測されませんでした。 Myc→His精製も前向きに考えてみます。

(無題) 削除/引用 No.3107-10 - 2014/06/07 (土) 00:19:51 - somacho >hai さん 使用したキットはE.coliのライセートを用いたin vitro翻訳系になります。反応液として、添付のE.coliライセートとバッファーおよびプラスミドを加えて、37℃、8時間の震盪により蛋白質が発現されます。RNaseを反応液内に添加する訳ではないのですが、E.coliライセートにそもそもRNaseが存在している可能性があり、そのRNaseと目的蛋白質の相互作用を疑っております。 実は変異体のためのプラスミドは既に作成してあります。 しかし、仮に変異体にRNase活性が認められなくなったとしても、 変異によって、目的蛋白質がもつRNase活性が失われたのか、目的蛋白質とRNaseとの相互作用が失われたのか、といった疑問は残ると思い、躊躇しています。 貴重な御意見、本当にありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3107-7 - 2014/06/07 (土) 00:02:05 - somacho >APさん 特異的なRNase Inhibitorを使うのは手ですね。 また、さらなる精製を試みたいと思います。 貴重な御意見ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3107-6 - 2014/06/06 (金) 23:49:03 - somacho >おお さん 貴重な御意見ありがとうございます。 更なる精製を試してみようと思います。 tRNAを入れてみるアイディアは全く思いつきませんでした。 しかも、すぐにできる実験が組めそうです。 前向きに考えてみたいと思います。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3107-5 - 2014/06/06 (金) 11:24:06 - hai とりあえずキットのRNaseが心配なら一回入れずにやってみる？？入れないと精製出来ない？？ 配列に加えて変異体作成とか？

(無題) 削除/引用 No.3107-4 - 2014/06/06 (金) 09:55:27 - 純度 純度が高いなら、１はそのまんまその現象が証明になりますね。１と２はMycでも精製してみたらどうなるか？　抗体と解離させる必要はかならずしもありません。配列上からRNaseだと推測できますか？ Mycで精製して、はずして、コバルト・レジンが良いかも。

(無題) 削除/引用 No.3107-3 - 2014/06/06 (金) 09:50:40 - AP >�@の場合、どうやって目的蛋白質がRNaseであることを証明したら良いか、 HPRI (human placental RNase inhibitor)とかvanadyl ribonucleoside complexなどの、特異的なRNase inhibitorを加えてみて分解が抑制されるか見てみる。 >�Aの場合、どうにかしてRNaseを分離して目的蛋白質だけを精製できないか、 HPRI存在下で反応を行う ゲルろ過クロマトグラフィーで分子量による目的タンパク質の分取をしてみる。 RNase-free DNaseを自作するときのように、iodacetate処理をしてみる（Molecular Cloningに記載あり）。

(無題) 削除/引用 No.3107-2 - 2014/06/06 (金) 09:44:42 - おお GSTは大量に取れますから、取れてきたGSTの溶液に多少コンタミがあっても目的の濃度まで希釈すると実験に影響がないほど希釈されるかもしれませんが、その収量が1/100であれば同じ蛋白の濃度にしてもコンタミの蛋白の濃度は100倍ですよね。 キットやレジンに顕著な相互作用がなかったとしてもやはり場合によってはコンタミしてくるRNase活性だけで十分やられてしまうかもしれません。 >�@の場合、どうやって目的蛋白質がRNaseであることを証明したら良いか、 イオン交換やサイズフラクショネーションなどでさらに生成して比活性を測ってみるのは手かもしれません。コンタミ成分の活性なら精製度があがれば比活性はおちますので。劇的に落ちることも想像に難くないです。コファクターの可能性は議論しないといけないかもしれませんけど。 �Aの場合、どうにかしてRNaseを分離して目的蛋白質だけを精製できないか、 これも更なる精製で解決する可能性は高いのでは。 ある程度精製しても解決しないなら、反応系に邪魔にならないならtRNAなどを入れてみる。RNaseにたいしてはきしつが飽和するので目的のものが壊れなくなると思います。 RNase inhibitorも従来のものより幅広いものに対して有効でDTTなど入れなくても有効なものもでまわってます。反応系で使ってみてもいいんじゃないでしょうか。 http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/life-science/dna-rna-purification-analysis/rna-extraction/rna-extraction-products/rnase-inhibitors.html

精製蛋白質がRNaseとともに精製されている可能性 削除/引用 No.3107-1 - 2014/06/06 (金) 09:16:05 - somacho 失礼致します。 現在、ある蛋白質の機能を解析するため、本蛋白質の精製を試みているのですが、以下の問題に直面したため、質問させて頂きました。 E. coli S30 T7 High-Yield Protein Expression System（Promega）を使って、in vitroで目的蛋白質（Myc Hisタグ付加）を発現させ、コバルト・レジンを用いて目的蛋白質を精製しました。 本方法では蛋白質の収量は低いのですが、大腸菌ならびにバキュロウイルスを用いて目的蛋白質が精製出来ず、苦肉の策として本方法を採用しています。 こうして精製してきた目的蛋白質を、32Pでキャップ構造をラベルしたRNAとRNase/DNase free waterを混和し、25℃、30分で感作させ、抽出したRNAをオートラジオグラフィーにて検出を試みたところ、RNAのシグナルが完全に消失しました。同時に同様の方法で精製してきたGSTでは、RNAのシグナルが消失することはありませんでした。この結果から、精製した目的蛋白質抽出液にRNaseの存在が疑われます。 もちろん単純なRNaseのコンタミの可能性も考えられるのですが、同時に同様に精製したGSTではRNAの消失が認められなかったことから、 可能性として、�@目的蛋白質そのものがRNaseである。�AE. coli S30 T7 High-Yield Protein Expression Systemにて発現させた目的蛋白質と本キット内に含まれるRNaseが相互作用し、複合体として精製されている。の２つが考えられると思います。 �@の場合、どうやって目的蛋白質がRNaseであることを証明したら良いか、 �Aの場合、どうにかしてRNaseを分離して目的蛋白質だけを精製できないか、 と考えているのですが、情けないことにアイディアがありません。 どんな御意見でも構いません。ご教示して頂けると幸いです。

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