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(無題) 削除/引用 No.3106-6 - 2014/06/06 (金) 13:15:05 - だい みなさま、どうもありがとうございます。自分の言葉の使い方が完全に誤っていたことをお詫び申し上げます。 自分が行っている実験は、目的の遺伝子A, B(それぞれの濃度は未知です)が発現している臓器から採取したcDNAをスタンダードとして希釈系列を作っているため、絶対定量ではなく、相対定量でした。リアルタイムPCRの器械にabsolute quantificationと書かれていたのをそのまま鵜呑みにしてしまっておりました。 もともと濃度が未知のサンプルを希釈系列のもとにしていますのでinternal controlであるA遺伝子の発現量で補正し、B遺伝子の発現量をサンプル間で比較することはできても、A遺伝子とB遺伝子の発現量を同一サンプル間で比較することはできないという基本的なことを勘違いしていたのだと思われます。 皆様の貴重な時間を無駄にしてしまって申し訳ありませんでした。 R様 ご指摘の点、大変勉強になりました。自分で増幅曲線を確認し、傾きがほとんど一緒であることから増幅効率は良好であることが確認できました。

もしや相対定量 削除/引用 No.3106-5 - 2014/06/06 (金) 12:04:18 - ふみ 最初の質問文中に「standardになるサンプルを5倍ずつ5段階に希釈し、A, Bのプライマーで検量線を描きます」とあります。 標的遺伝子A,Bともに検量線をかくためのDNA溶液が共通だったりするのでしょうか？？ それはともかく、定量的PCRについて説明した実験書もしくは解説文として何を読みましたか？

(無題) 削除/引用 No.3106-4 - 2014/06/06 (金) 10:17:37 - R >原液(625コピー) 濃度既知で両遺伝子とも625 copyなら、定量後の相対値が1になる実験系を組んでいるのでは。 >遺伝子やプライマーが違っても、Tm値が大きく違わなければアニールはほぼ同様に起こり、二つの遺伝子のCt値だけで量を比較できるものなのでしょうか？ お示しの時の両遺伝子の増幅に対する検量線を並べてみれば、わかりやすくなるのではないでしょうか。 検量線の傾きが大きく異なるということは、増幅効率も大きく異なります。 (検量線の傾きが同じという前提で相対定量が行われます) (机上の想定だけではなく、実際に増幅効率を確かめることは大事ですね)

(無題) 削除/引用 No.3106-3 - 2014/06/06 (金) 10:17:13 - だい すみません、考えすぎて混乱してしまっているのかもしれません。 普通に考えて、もちろんプライマーが適切に設計されている条件のもとで、A遺伝子のCt値が25でB遺伝子のCt値が20であればB遺伝子の発現量/A遺伝子の発現量=32という理解でよいのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3106-2 - 2014/06/06 (金) 09:56:23 - おお >[Re:1] だいさんは書きました : > お聞きしたいのは、ここで「A遺伝子については25サイクルでthresholdに達する量が625」、「B遺伝子についても20サイクルでthresholdに達する量が625」という風にコンピューターが規定するのでしょうか？もしそうだとすると仮にstandardと同じサンプルをunknownサンプルとして別のウェルでPCRすると、B遺伝子発現量/A遺伝子発現量は必ず625/625=1になることになります。 いやもうちょっと頭を整理してからもう一度質問していただけませんか。。。

リアルタイムqRTPCRの絶対定量について 削除/引用 No.3106-1 - 2014/06/06 (金) 09:07:10 - だい はじめまして、リアルタイムRTPCRについて、よくわからないことがあるのでアドバイスをいただければと思い、投稿します。今、マウスのある組織から採取したcDNAをもとに、リアルタイムRTPCRを行って遺伝子の発現を調べています。リアルタイムの定量方法に、検量線を描く絶対定量と、描かない相対定量がありますが、今回お聞きしたいのは絶対定量の方です。 たとえば、Aという遺伝子をinternal controlにして、Bという遺伝子の発現量を評価したいとします。そこでstandardになるサンプルを5倍ずつ5段階に希釈し、A, Bのプライマーで検量線を描きます。5段階の希釈液の中のコピー数をたとえば、1, 5, 25, 125, 625と入力したとします。そして原液(625コピー)のA遺伝子のCt値が25、つまり25サイクルでthresholdに達したとします。同様にB遺伝子のCt値が20であったとします。 お聞きしたいのは、ここで「A遺伝子については25サイクルでthresholdに達する量が625」、「B遺伝子についても20サイクルでthresholdに達する量が625」という風にコンピューターが規定するのでしょうか？もしそうだとすると仮にstandardと同じサンプルをunknownサンプルとして別のウェルでPCRすると、B遺伝子発現量/A遺伝子発現量は必ず625/625=1になることになります。 普通に考えればA遺伝子のCt値が25でB遺伝子が20なのだから、B遺伝子発現量/A遺伝子発現量=32であるということになりますが、どちらなのでしょうか？遺伝子やプライマーが違っても、Tm値が大きく違わなければアニールはほぼ同様に起こり、二つの遺伝子のCt値だけで量を比較できるものなのでしょうか？ それともやはり前者が正しく、あくまでもB遺伝子の発現量についてstandardとunknownを比較することはできても、A遺伝子とB遺伝子のtranscript比を検証することはできないのでしょうか？ いろいろ考えていたら分からなくなってしまったので、ご教示お願いいたします。

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