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(無題) 削除/引用 No.3103-8 - 2014/06/05 (木) 22:14:15 - おさ monさん ありがとうございます。ヒストン、チューブリンあたりでやってだめなら、全タンパクでいきたいと思います。 また細胞数で揃える方法も行い、データを比較して検証してみたいと思います。

(無題) 削除/引用 No.3103-7 - 2014/06/05 (木) 22:07:02 - mon WBで良いコントロールがなければ、ブロット上（あるいはゲル内の）全タンパクを染色した像を載せてローディングコントロールとしますよ。 まあ、複数のタンパクを調べてみるのも今後のために良いと思います。ラミニン、TopoII、ヒストンとか使えないかな？

(無題) 削除/引用 No.3103-6 - 2014/06/05 (木) 19:38:36 - おさ 皆様早速の回答ありがとうございます。 説明がわかりづらくてすみません。 死細胞を含めたCdc2のタンパク質量の変化を見ようとしています。 その際、Cdc2を含めタンパク質全量も減少していく可能性がありますので、その場合ローディングとの比でとってもCdc2の正しい量的変化を追えないと思い悩んでいます。（G0期に入ってから５日以上細胞内で減少しないことが知られているローディングコントロールがあれば出来ますが） やはり細胞数をそろえることが良い方法だと思うのですが、現実的に実験誤差や破砕効率の差など、例え回収時の細胞数が一定であったとしても、どこまで同じ条件で出来てるかを証明する手段がありません。 なのでそれ以外でなにか良い案がありましたら、是非知りたいです。 変な質問ですみません。

(無題) 削除/引用 No.3103-5 - 2014/06/05 (木) 17:31:54 - mon 酵母はなかなか死なない印象がありますが、死菌の割合をサンプリングとともに調べてみてはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3103-4 - 2014/06/05 (木) 17:27:13 - mon >５日も培養するとタンパク質の分解がかなり進んでいると考えられる ということは、細胞(菌）が死に始めているということですか？ 調べたい＝「現象を正しく見る」のは「生死関係なく菌体あたりのCdc2(CDK1)タンパク量」ですか、それとも「生菌中のCdc2(CDK1)タンパク量」ですか？ 「生菌中のCdc2(CDK1)タンパク量」だとすれば、死菌は洗浄すれば除けませんか？

(無題) 削除/引用 No.3103-3 - 2014/06/05 (木) 17:20:22 - 774R >５日も培養するとタンパク質の分解がかなり進んでいる これはどういう意味でしょう？ 回収した細胞の中に、分解したタンパクが含まれる様に読めますが、細胞の死骸？などの割合が増えるということでしょうか？そうであれば、体積で合わせるのも同じような問題が残ると思われます。 知りたいことは、細胞当たりのCdc2の発現量ですよね？ であれば、Cdc2ウェスタンしたメンブレンを使って、生細胞が持つタンパクAでリプローブして、Cdc2/A　のようなレシオで示すのではどうでしょう？ これなら、ローディング量の誤差や転写効率のばらつきをキャンセルして定量化出来ると思います。 分裂酵母は扱ったことはありませんが、哺乳細胞ならアクチンとかチューブリンとか、ハウスキーピングなタンパクを基準に使うことが多いです。

(無題) 削除/引用 No.3103-2 - 2014/06/05 (木) 17:19:53 - papa 一細胞あたりのタンパク質全量（分母となる）は，変動する可能性があるので正しく量的変化をとらえられない恐れがあります。 私なら，OD unitで合わせますが。 体積でも理論的によいと思いますが，正しく揃えられますか？

長期培養におけるウェスタンブロット 削除/引用 No.3103-1 - 2014/06/05 (木) 16:12:53 - おさ こんにちは。 大学院の学生です。 現在、分裂酵母を栄養源豊富培地で培養し、０、１、２、３、５日で細胞回収をし、Cdc2(CDK1)というタンパク質の量的変化をウェスタンブロット法で見ようとしています。 しかし、SDS-PAGE時のタンパク質濃度調製の時に、全サンプルのタンパク質濃度を素直に合わせていいか迷っています。 ５日も培養するとタンパク質の分解がかなり進んでいると考えられるので、そこで０日目や１日目と同様のタンパク質濃度にする事で、現象を正しく見る事ができるのか不安です。 やはり細胞回収時の体積で合わせて（いつも合わせていますが）、タンパク濃度は揃えずにPAGEするべきでしょうか どなたか回答もしくは何かいい案がありましたら教えてください。お願いします。

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