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(無題) 削除/引用 No.3097-16 - 2014/06/06 (金) 02:44:18 - おお >その後無菌の溶液を使い無菌に保てるといえる操作をするということでまず実験がいままでできています。 必ずしも無菌操作とかきませんでした。普通に実験台でやっているのが現状です。直接指がチューブの口とかに触れたりとか、開けっ放しで放置とか菌体を良く使うベンチで使わないとか、そう言うベンチしかないのであればアルコールなどでふいて少し慎重にやるとかそんな感じではあります。もちろん念のためにクリーンベンチで作業することを何ら否定する理由はありません。

(無題) 削除/引用 No.3097-15 - 2014/06/05 (木) 10:30:11 - AA 開けるたびに毎回オートクレーブするほど気を使うなら、 フィルター滅菌したものを1回分ずつ分注してしまえば良いのでは？ と言うのは筋違いの指摘ですかね？ DNA溶液だと量が少ないからフィルターろ過滅菌は厳しいでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3097-14 - 2014/06/05 (木) 09:49:16 - ~ ベクターの殺菌のために、トランスフェクション前にエタ沈する人はいますね。 そういう人なら、殺菌後に滅菌TEを使う意味が出てくるのかもしれません。 私はやっていませんが。

(無題) 削除/引用 No.3097-13 - 2014/06/05 (木) 09:42:07 - ポスドク参年目 >[Re:11] Clockさんは書きました : > ポスドク参年目さん > > ではプラスミドの抽出は無菌操作でされてるのでしょうか？ > 抽出過程で落下細菌等が混入しているのでTEがいくら無菌であっても意味がないのでは？ 私は今のラボでは細胞用プラスミドをQiagenのmidi-prepキットで準備していますが、これは最後に70% EtOHでwashするステップがあり、ここからはクリーンベンチで無菌操作ですね。 お試しでmini-prepキットで準備したものを細胞に入れることがありますが、このキット(Promega)だとそのようなステップがないので、抽出後にエタ沈を行い、これも70% EtOHでwashするところからクリーンベンチです。 一度、このステップを省いて細胞に入れた時に(頼まれ仕事でやったもので、濃度が薄かったので大量にDNA溶液を入れたからというのもあったと思いますが)コンタミした経験もあって、70% EtOHでのwashは滅菌効果も狙って必ずやるようにしています。

(無題) 削除/引用 No.3097-12 - 2014/06/05 (木) 09:25:59 - おお 私に対する質問ではないのですが、プラスみど精製に関しては無菌でやるというのはやってませんし、やってないのがたいていではないでしょうか。 コンタミのたぐいその後の実験系によりますが、たいていのマンマルへのトランスフェクションであれば、エタチンご、70%エタノールwashの時にきんは全滅しているだろうということで、その後無菌の溶液を使い無菌に保てるといえる操作をするということでまず実験がいままでできています。 キットについてくるカラムだとか、無菌とうたってるものはなかったように思いますので(その他溶液やチューブはうたってるかもしれませんけど)、まあ精製過程での厳密せいはそこまで厳しくなくていいんじゃないでしょうかね。

(無題) 削除/引用 No.3097-11 - 2014/06/05 (木) 09:09:33 - Clock ポスドク参年目さん ではプラスミドの抽出は無菌操作でされてるのでしょうか？ 抽出過程で落下細菌等が混入しているのでTEがいくら無菌であっても意味がないのでは？ TEと上記の件は別問題ではありますが、TEはプラスミドを溶かす溶媒として使用している限りではクリーンベンチで開け閉めする必要性を感じません。

(無題) 削除/引用 No.3097-10 - 2014/06/05 (木) 05:31:42 - ポスドク参年目 すいません。先の投稿で間違っていました。tokiさんは >細胞へのトランスフェクションレベルであるなら一度オートクレーブしていれば無菌操作でなくても良いと思います。 と書かれていたのを、かけなくても良いとおっしゃっているがなどと勝手な解釈を書いていました。申し訳ありません。 ただ、私はやはり細胞に使うものはすべて無菌操作の下で行う方が良いと思うので、トランスフェクションに使うTEはオートクレーブして、その後はクリーンベンチ内でのみ開けます。

(無題) 削除/引用 No.3097-9 - 2014/06/05 (木) 00:18:02 - ポスドク参年目 TEをオートクレーブするのはDNase不活性化が目的だと習いました。で、最近は水もDNase RNase freeのものを買って使うことが多く、オートクレーブする必要性はないかと。そもそも、オートクレーブでDNase不活性化というのは気休めみたいなものだと、自身の経験からもちょっと上の先輩からの教えからもそう思いますし(年齢によって印象が違うのかも。かなり上の年代だと必須?)。 ただし、トランスフェクションに使うベクターを溶かすのに使うTEは、滅菌が目的でオートクレーブかけます。tokiさんはかけなくてもとおっしゃいますが、細胞にふりかけて数日待ってから回収が一般的だと思いますので、その間に菌がどのように影響するかわからないことを考えると、私は怖くて滅菌していないものを使う気にはなれません。培養細胞に使うものは全てオートクレーブかフィルターで滅菌が基本だと私は思います。 LBは私もクリーンベンチ外で開けてます。開けたらすぐ閉める、基本的にバーナーの炎のそばで開ける、保存は4Cで。培養細胞が菌に触れたらクリティカルになにかが起こる心配があるのと違って、こちらは万が一菌が入っても、コロニーを拾って増やす時に抗性物質でセレクションをかけるから、問題になるほど増えるようなことはまずないと思います。私は一応コロニーをつついてないLB+抗性物質のチューブを常に一本準備しますが。

(無題) 削除/引用 No.3097-8 - 2014/06/04 (水) 23:28:11 - おお LBの無菌操作は基本ですが、クリーンベンチでやるほどでもない場合もあります。実験台で即座にやれば、滅菌された器具を使う限りそんなにコンタミで困ることはありません(ただし、分子生物学的手法レベルでは)。あらかじめ抗生物質いれて4度保存というのもてですし、一度あけたやつは念のため4度で保存している方もいるかと。 溶液の滅菌の繰返しはデメリットがおおきいのでやらない方がいいです。TEにかんしては、DNAを制限酵素できったりとかそう言うレベルで使うものに関しては無菌操作はひつようありません。TEじしん滅菌されたものを使う必要もかんじません。 まんまるの培地にtransfectionするとか、非常に増えにくい菌体にtransformationするとかそう言うのであれば滅菌したものを使わないと結果は保証の限りではありませんが、クリーンベンチで完全な無菌操作をやるか、実験台で即座に開け閉めする程度にするかなどは、実験やラボの環境次第なので人により判断が違うかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3097-7 - 2014/06/04 (水) 23:01:44 - Clock Lbは無菌で操作しないと菌が増えちゃうんじゃね？ 一回一回使い切り出ない限りは無菌で操作が基本でしょ

(無題) 削除/引用 No.3097-6 - 2014/06/04 (水) 21:47:06 - TK-1 >[Re:5] tokiさんは書きました : > オートクレーブを一つの試薬で何度もすることについてですが、私のラボで以前LB培地をクリーンベンチ外で開けてしまった人がいました。 LBをあけるのにいちいちクリーンベンチでやる必要もないかと思います。大きな問題は最近は（こんなことを言ったら年寄りみたいですが）なんでも”上の先生”に教えてもらえるのが当たり前になっているのか頭を使って操作の意味を考えられる人が少なくなっているのに加えて、、逆にコミュニケーションをキッチリ取れる人が少ないんでしょうね。ここのフォーラムを見ているとそんな気がします。

(無題) 削除/引用 No.3097-5 - 2014/06/04 (水) 20:17:27 - toki オートクレーブを一つの試薬で何度もすることについてですが、私のラボで以前LB培地をクリーンベンチ外で開けてしまった人がいました。 そのことを指摘したら「じゃあ今すぐオートクレーブしなおしたらいいんでしょ？」みたいなことを言い出したのです。 私が言いたいのは、滅菌できれば何でもいいのかということではなく、無菌操作で扱うべき物なのかどうかをよく考えて実験しなければならないということです。 TEに関しては無菌操作をする必要は無いと思います。 逆にその必要があるような実験系をお考えならPIや指導教員から言われるでしょう。 繰り返しになりますが オートクレーブを繰り返すと溶液が蒸発することで濃くなることが予想されますし、溶液の成分自体の分解・劣化に繋がる可能性もあるため、オススメしません。

(無題) 削除/引用 No.3097-4 - 2014/06/04 (水) 19:45:49 - ~ >元容器から分注する場合は無菌的に行っていますか？ いいえ。外で開けています。 ゴミが入り込まないように、蓋を開けっ放しで放置するようなことは避けていますが。 >非無菌的に使用した場合、毎回オートクレーブにかけるものなのでしょうか？ もし、毎回滅菌された溶液が必要であれば、いったん滅菌したものを小分けして保存し、使い切りとして使うことをお勧めします。 そのような作業をよしとしないのであれば、そもそも非無菌的に使用するという前提を見直してはいかがでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3097-3 - 2014/06/04 (水) 17:33:39 - 中年 繰り返しオートクレーブすることは避けた方が良いというtokiさんの意見に賛成です。 何に使うTEですか？そもそも無菌的である必要のある使い道なのでしょうか。

(無題) 削除/引用 No.3097-2 - 2014/06/04 (水) 16:30:04 - toki 毎回オートクレーブするのはTEに限らずやらない方がいいと思います。 細胞へのトランスフェクションレベルであるなら一度オートクレーブしていれば無菌操作でなくても良いと思います。私はこの扱いで問題が起きたことはありません。 vivoで使用するなら無菌の方がいいのかもしれません

TEバッファー 削除/引用 No.3097-1 - 2014/06/04 (水) 16:25:39 - ETC TEバッファーなのですが、元容器から分注する場合は無菌的に行っていますか？　また、非無菌的に使用した場合、毎回オートクレーブにかけるものなのでしょうか？

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