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(無題) 削除/引用 No.3096-4 - 2014/06/04 (水) 14:43:23 - おお Are you sure that your cells are expressing p21 well? You might want to get cells which are known to be expressing p21 enough to detect in general.

(無題) 削除/引用 No.3096-3 - 2014/06/04 (水) 14:39:50 - おお I was able to detect it by extracting with TBS containing 1% TRITON X-100. You are talking about the cyclin inhibitor, right? There are other p21s. RIPA buffer (TBS containing 0.1 to 1% deoxychalate, 1% TX-100 with or without 0.1%SDS) would also work, but p21 could be released from cyclin complexes. Release of p21 from complexes does not matter for WB analysis. You can also try SDS PAGE sample buffer without dye or 1% SDS in TBS. But, you have to remember that beta-ME and high concentration of glycerol disturb BCA protein assay, and high concentration of SDS is not available for Bradford protein assay.

(無題) 削除/引用 No.3096-2 - 2014/06/04 (水) 11:28:35 - L 抗体の質にもよると思いますが、私のラボでもp21はちょっと苦労した事があります。発現自体が確認できていないという事は、核移行も不明ということでしょうから、まずは細胞をSDSバッファーで直接サンプルにし、whole cell lysateとして少し多めで流してみてはどうでしょうか。できれば、ポジコン（強制発現、あるいはその細胞にp53系異常がなければDNA障害を起こす薬剤で処理）とネガコン（p21ノックアウトもしくはノックダウン）を準備した方がいいです。抗体によっては結構ノンスペが出ますし、必ずしも21kDaに出ない（少なくともマウス細胞では）と記憶しています。

p21タンパク調製方法 削除/引用 No.3096-1 - 2014/06/04 (水) 10:28:59 - ppp19 いつもお世話になっております。 現在ある細胞の実験を行っているのですが、p21のタンパクの発現をウェスタンブロットで確認しようと考えております。 以前にも同じサンプルで実験を行ったのですが、うまくバンドが検出できませんでした。 検出系に問題がある可能性の方が大きいとは思い、それに関しては共同実験者の方と話し合っているのですが、念のためタンパク調製法に関しても検討してみようと思いました。 前回は、高塩濃度のバッファーを用いてソニケーションも行いました。 核タンパクを約10μｇ　流したと思います。 細胞の状態に関しては、ある刺激（細胞周期がG1期に集積する）に関する実験なので、細胞周期を同調させることは行いません。 皆さんはp21の検出の際、どのように調製していらっしゃるでしょうか？ また、タンパク調製法以外にも、実験を行う際に注意すべきことなどありましたらアドバイス頂きたいと思います。 よろしくお願いいたします。

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