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(無題) 削除/引用 No.3094-5 - 2014/06/03 (火) 22:39:05 - おお コンプレックスの状態でepitope部位が露出していなければ、こういうことはおこります。なのでさほど不思議なことでもないです。 mycでIPなら、mycでなくターゲットの蛋白に体する抗体を使うとかタグの位置を変えるとかすると相互作用が見れるかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3094-4 - 2014/06/03 (火) 12:09:33 - mon となると、Protease等の問題はなさそうだし、以前成功した実験は非特異的吸着でないこと確認しているとして、 (1)逆というのは、Mycで落としてFlagでWBですか？ 汎用されている抗Myc抗体9E10をお使いなら、その親和性は抗FLAG抗体M2より弱いのでチョット気になります。 (2)「AタンパクをつってきてBでブロットするのは確認しており」との事ですが、お互いに収率はどれくらいですか？タンパクBはA以外とも結合するのでしょうか。相手が多いと感度は落ちますよね。 (3) IP中に外れてないように、DSP等でクロスリンクしてIPする方法もあります。

(無題) 削除/引用 No.3094-3 - 2014/06/03 (火) 11:54:43 - 免疫沈降 mom様 早速のお返事ありがとうございます。 （１）発現量は依然と特に変わりがありませんでした。 （２）こちらに関しても確認しておりますのでIP効率は問題ないと思われます。 （３）細胞は起こしなおして２、３回継代しています。また撒く数なども以前と同じように実験しています。

(無題) 削除/引用 No.3094-2 - 2014/06/03 (火) 11:48:15 - mon 基本事項の確認はしていますか？問題を切り分けましょう。 (1)AおよびBの発現量は以前と同じ？＝transfection効率の確認 (2)Co-IPではなく、単独のIPはできている？検出感度等は落ちていない？＝IP効率の確認 (3)細胞（培養）の状態に変化はないか？

IPでの結合確認 削除/引用 No.3094-1 - 2014/06/03 (火) 11:22:16 - 免疫沈降 いつも参考にさせていただいております。 一過性のトランスフェクションを行い、IP/WBでタンパク同士の結合を見ているのですが以前確認できたはずのバンドが検出できなくなりました。 IPはFlagで、WBはMycでやっています。 それぞれの抗体は機能することを確認しています。 AタンパクをつってきてBでブロットするのは確認しており、 その逆が再現できない状態です。 以前は２度ほど確認しておりましたのでなぜ検出できなくなったのか理由がわからず困っております。 心当たりとしてはベクターをしばらく室温で放置していたことくらいです。 あとは実験条件等は全て上手く検出出来ていたときの物と同じです。 皆様のご経験で、同様の問題が生じたことはありますでしょうか？ 解決方法に心当たりがあればコメントよろしくお願いします

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