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再度御礼申し上げます。 削除/引用 No.3084-12 - 2014/05/30 (金) 12:53:07 - mari ―〜様、ぷら様、mon様、AP様、お返事有り難うございます。 ―〜様、まだ実際にPCRにかけてはおらず、プライマーダイマーを確認したという状況ではないです。（その遙か以前の段階で止まっておりました） また、ぷら様から御教示いただきました、5’側に付加する余分な塩基配列が、制限酵素で異なる事、存じませんでした。教えて頂きましたHPをチェックし、確認致します。 Mon様が教えて下さったamplifyについては、windowsを使用しており、うまくダウンロード出来ませんでした。（情けないことにコンピューター関係もからきし駄目です。）他に教えて頂きましたサイト、アクセスしてみます。 AP様、再度の御教示有り難うございます。 ご指摘の通り、まずはゲノムDNAからのプライマリークローングの為のPCRプライマー設計が必要です。（昨日、他講座の研究者さんよりご指摘頂いた、私の勘違いポイントはここにもありました。） 同じように迷うかもしれないどなたかの為に、私がどのように勘違いしていたのかについて、恥を忍んで書かせて頂きます。 「プロモーター領域の中で、ある程度アタリをつけた領域（転写因子が結合するとされてているコンセンサス配列）が何カ所かある。それらの領域に合わせて、ある程度は領域をこれこれこういう感じで振って行こう、とまでは考えていた。（今回行おうとしている手法は「deletion assay」という名称だという事も昨日初めて知りました。）それらの全ての領域に合わせてプライマーを設計し、全てgDNAから釣り上げてくるものと考えていた」 ←正しくは、まずプライマリークローニングのための領域を大き目に切り取ってくる。次に、その大き目断片をシークエンスして配列の間違いが起きていない事を確認する。問題なければ、それを鋳型にして目的断片を取得するのが安全で効率が良いのですね。 皆様からご指摘を頂くと、どのご意見も非常に納得できる事ばかりですが、自分では思いつけませんでした。本当に有り難うございます。

(無題) 削除/引用 No.3084-11 - 2014/05/30 (金) 12:18:37 - papa ＞「制限酵素の5’側に、少なくとも2bpの余分な塩基配列を付加しなければいけないが、その配列は自由にして良いという事。 余分な配列はGやCなどの方が二本鎖が解離しずらいので,制限酵素の切断には良いと聞いたことがあります。−制限酵素が結合し易いため。 NEBの余分な配列の必要数の解析では，余分な配列はGCで構成されていたと思います。 ただ，余分な配列を5つや6つもつける場合は，確かに適当にAやTを混ぜますが。

(無題) 削除/引用 No.3084-10 - 2014/05/30 (金) 11:38:35 - AP つまり「プロモータアッセイのための」というより「ゲノムDNAからのプライマリークローニングのための」PCRプライマーの設計ということですね。 プロモータアッセイのためと書かれているので、ピンポイントで狙った領域を増やすとか、カバーする領域をいろいろ振るとかを想定して、そのためには当然、当該領域のクローニングが済んでいるものと思ってしまいました。 もしアッセイに使う断片をゲノムからいきなり増やそうとしているなら、一旦、当該領域を含む断片をクローニングしてから、それを鋳型にアッセイに用いる断片を取得するほうが安全だと思います。 必要と考える領域を内包するように外側にプライマーを探せばいいので、自由度は高いと思います。あんまり遠すぎるとPCRが難しくなりますが、短い距離でダイマー形成しやすいまあまあのプライマーを選ぶより、少々距離が長くなっても、いいプライマーを使ったほうがいいと思います。 また、ゲノムDNAなどからいきなり制限酵素サイトなど余計な配列が付いているプライマーでPCRをかけようとすると、失敗しやすいので、まずは余計な配列の付いていないプライマーで増幅（必要ならクローニング）して、それを鋳型にテール付きプライマーで（nested PCRも適用可、一旦単離したDNA断片を鋳型にするのでプライマーの設計はそれほど厳密でなくていい）制限酵素サイトを付加するのを、私なら勧めます。 AmplifXはwindows版もなかったかしら？

(無題) 削除/引用 No.3084-9 - 2014/05/30 (金) 10:35:13 - mon 私はMacなので、Amplify3（Lion以降に対応したVer3.2は作者に問い合わせる）やAmplifXを使用して3'側の配列を何処までにすれば特異性が上がるか目安にしています。 Windowsだと、 http://molbiol-tools.ca/molecular_biology_freeware.htm あたりにありそう（Mac版もあるソフトも含まれる）。 SerialClonerでもできそう。

(無題) 削除/引用 No.3084-7 - 2014/05/30 (金) 10:11:58 - ぷら gDNAからプロモーター配列を拾うためのプライマー設計でしょうかね。 制限酵素サイトの5'側に余分な塩基を付加するのは、PCR産物を直接制限酵素で切断する場合必要で、長さや配列も制限酵素で異なります。昔は、NEBのカタログやHPに載ってましたが、今はどうでしょう。TAクローニングなどでベクターにPCR産物をそのまま組み込める場合は、付加する必要性はないです。 gDNAを鋳型としたPCRが作製したプライマーでかかりづらい場合は、nested PCRをすることで改善できます。

(無題) 削除/引用 No.3084-6 - 2014/05/30 (金) 09:57:26 - ~ あまり考えずに、primer3に選んでもらっています。 いいプライマーができないというのは、実際にやってみてプライマーダイマーが増えたという意味でしょうか？ プロモーターアッセイ用であれば、テンプレートはベクターですよね。 多少非特異が増えたとしても、5サイクルぐらいで目的のサイズのものを取れませんかね。

(無題) 削除/引用 No.3084-5 - 2014/05/30 (金) 09:18:04 - mari seven様、AP様、TS様、お返事下さり有り難うございます。 primer3にて、早速チェックさせて頂きます。 （なお目的とするプロモーター領域を釣り上げる為のDNAの配列は、精製されたものは現在所属講座には存在しません。購入なども金銭的な問題で難しいと思いますので、自分の口腔内から採取した擦過細胞からgDNAを抽出して、そこから釣り上げてくる予定しております） また、他の御二方がご指摘下さった通り、配列の選択の余地が殆どないので、実験の主目的を最優先にプライマー設計するしかないようです。 実は、昨日、他講座に所属する研究職の方から指摘されたのですが、私は他にも色々と勘違いしていたようで、プライマー設計に関し、自分で自分に制約をかけすぎていたようです。 もしどなたかの参考になればと思い、下記に勘違いしていた内容を具体的に書かせていただきます。 「制限酵素の5’側に、少なくとも2bpの余分な塩基配列を付加しなければいけないが、その配列は自由にして良いという事。（Tm値が高すぎるのであれば、そこにTとかAとかを多めに付加すれば良い）←私はここを、目的配列に対応した塩基でないといけないと勘違いしていたため、Tm値が非常識な値になってしまったり、散々でした。）」 重ねて御礼申し上げます。 有り難うございました。

(無題) 削除/引用 No.3084-4 - 2014/05/29 (木) 16:22:00 - TS クローニング、サブクローニングのときには、配列の選択の余地があまりないと思いますが。ちょっと長くしたりとか短くできたりだけですよね。 APさんもおっしゃる通り、あまり考えなくてもいいのでは？

(無題) 削除/引用 No.3084-3 - 2014/05/29 (木) 16:06:25 - AP 目視で判断する。 ゲノムやcDNAプールのような複雑性の高いDNAを鋳型にするときはプライマー設計がかなりクリティカルですが、一旦クローニングされて精製されているDNAを鋳型にするときは、そんなに神経質にならなくてもいいと思います。 特に、コンストラクト作製のときは、プライマーの位置はずらしようがなかったりするので、プライマー設計の種々のガイドラインより、目的重視で設計します。

(無題) 削除/引用 No.3084-2 - 2014/05/29 (木) 15:46:03 - seven primer3plusとかどうでしょうか？ taskのところをprimer_Checkにすればチェックできます 5'側にアダプターをつける場合でも3'側のプライマーの特異性やTm値が常識的な範囲ならそこまで気を使わない（アダプターの影響を考慮しない）でも大丈夫だとおもいますよ。

自作プライマーの3'セルフコンプリメンタリティのチェック法は？ 削除/引用 No.3084-1 - 2014/05/29 (木) 11:19:38 - mari 大学院生、研究初心者です。 プロモーターアッセイに使用する為のプライマー作成を試みております。 （いつもはprimerBLASTで作成しているのですが、今回は、自分で目的とした配列に合わせてプライマーの配列；制限酵素＋特異配列でtotal 30bpを決定しました） この自作プライマーの3'側のself complemetalityのチェックをする事ができる便利ツール等がございましたら、教えて下さい。 （最初、primerBLASTでプライマーを適当に作成してから、制限酵素を5'側にくっつけて作成しようと考えたのですが、あまり良いプライマーが作成できず困っております） 何卒宜しくお願い申し上げます。

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