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酵母の植え継ぎ トピック削除
No.3083-TOPIC - 2014/05/29 (木) 11:08:34 - 初
実験初心者です。初歩的な質問ですみません。
大腸菌は多少取り扱い経験があるのですが酵母は初心者です。

この度、酵母で実験を始めるにあたり、酵母株と酵母にベクターが挿入された株をプレートの状態で分与していただきました。
これを継代培養し、グリセロールストック及びプレート保存したいのですが、大腸菌と同じように、リストリークし生えてきたシングルコロニーを培養すればよいでしょうか。
酵母だと、注意しなければならない点はないでしょうか。ご教授いただけると幸いです。よろしくお願いいたします。
 
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No.3083-9 - 2014/05/30 (金) 17:52:00 - 弘法
私たちは慣れているので大腸菌と同じように使えると思っていますが、意識していないところで気を付けないといけないような操作があるのかもしれません。

もし、近所に酵母のラボがあるなら、見学させてもらったり、最初のうちは操作を見て貰ったりした方が安心かもしれません。酵母の分野はそういうことを嫌がらない伝統があるように思いますので、気楽に頼んでみては?

(無題) 削除/引用
No.3083-8 - 2014/05/30 (金) 17:43:31 - 弘法
> 親株はYPD、ネガコンはSD培地です。SDが死にやすいというのは、栄養が選抜してあるからでしょうか。

栄養のバランスが悪いせい、みたいな言われ方をしますが、本当のところは理由はよく分かりません。

> もう一つお聞きしたいのですが、大腸菌の実験系と酵母の実験系は器具・機械共に厳密に使い分けした方がよいのでしょうか。

うちでは一切使い分けはしていません。どちらかにどちらかがコンタミすることを心配しておられるのでしょうか?大腸菌を問題なく取り扱える無菌操作ができているなら問題ないと思います。

(無題) 削除/引用
No.3083-6 - 2014/05/30 (金) 07:32:17 - 弘法
なるほど。タンパク質発現のためのホスト株で、何か特別の変異を持っていてそれを利用するようなものではないんですね。そういうことでしたら、ポジコン云々の話は忘れてください。

いくつか質問があります。

酵母というのはSaccharomyces cerevisiaeのことですよね?

プラスミドで形質転換されている方の株は、されていない株に使おうとしてる発現ベクターを形質転換した、いわば発現のネガコンなのでしょうか?それなら、自分で形質転換しなおせば同じものがすぐに作れますよね。

冷蔵庫に2ヶ月放置されていたということですが、形質転換体を選択するSD培地(SC培地)の上だと、YPD培地に比べて酵母はかなり死にやすいので、YPD培地の上で取ってあった株の方が安心だと思います。ネガコンだからあまり気にしなくてもよいのかもしれませんが。

> そうなんですね。大腸菌の時はプラスミドとってダイジェストで確認してから確実なものを保存していたので、確認すべきかなと思ったのですが、確かに酵母だとプラスミドなかなかとれないですね。。コロニーPCRでひとまず、ベクター入りのはチェックできそうです。

もちろん酵母でも確実なものをストックしたいのですが、それが容易ではないということです。特にタンパク質高発現を目的としているときなどは、グリセロールストックを複数株について行うとともに、それらについて小スケールで発現を見て、きちんと発現が確認されたものを使うことになります。場合によっては、毎回、新たに形質転換しなおした方が発現が安定する場合もあります(大腸菌での発現も同じですよね)。

(無題) 削除/引用
No.3083-4 - 2014/05/29 (木) 23:12:15 - 弘法
> ・酵母は倍加時間が大腸菌よりも長いためコロニーが生えてくるのに2〜3日かかるのでしょうか。

そのとおりです。3日見ておいた方が安心です。倍化時間は元気なときで90分、選択培地だと簡単に2時間位にはなります。

> ・分与していただいてから、2月ほど経っているのですが、厳しいでしょうか。とりあえずやってみないと分からないですが。

あまり望ましい状態ではありませんが、現状では仕方がないですよね。リストリークしてコロニーサイズが揃っていれば、ひとまず良しとするしかないと思います。でも、何らかのポジコンで、その株が望む性質を備えていることチェックしてから使いたいです。

> ・生えてきた形質転換体ですが、目的のものかはどのように確認すべきでしょうか。ベクター入りのものは、ベクター上の制限酵素サイトで切断すればよいのかなと思うのですが。。親株の確認は通常どのようにするのでしょうか。

それは目的次第ですね。もちろん、気をつけてfreshに扱っていれば、まず問題がないからチェック無しでストックしてしまうのですが、今回のような状況だと、お使いの目的にかなう性質を失っていないことを、ポジコンを使って確認したい気がします。ベクター上の制限酵素サイトで切断すると言っても、大腸菌のようにプラスミドをすぐに増やせるわけではないので、PCRで当該領域を増幅してチェックするか、プラスミドをいったん大腸菌に回収(rescue)して、それが正しい構造をしているかどうかを確かめる必要があります。

差しさわりのない範囲で実験の目的と株の性格を教えていただけたら、もう少し個別の話ができるかもしれません。


>
>
> 多数質問すみません。よろしくお願いいたします。
>

(無題) 削除/引用
No.3083-2 - 2014/05/29 (木) 11:46:19 - 弘法
リストリークし生えてきたシングルコロニーを培養してグリセロールストックすれば良いです。大腸菌と違う点を挙げるとすれば、細胞サイズがずっと大きいので、大腸菌のセンスでストリークすると薄くなりすぎるかもしれないことくらいでしょうか。また、生えてきた形質転換体をプレートごと4℃で保存するときは、あまり長持ちしないので、変な選択を掛けたくなければ一週間〜十日程度を目安にした方が安心です。

酵母の植え継ぎ 削除/引用
No.3083-1 - 2014/05/29 (木) 11:08:34 - 初
実験初心者です。初歩的な質問ですみません。
大腸菌は多少取り扱い経験があるのですが酵母は初心者です。

この度、酵母で実験を始めるにあたり、酵母株と酵母にベクターが挿入された株をプレートの状態で分与していただきました。
これを継代培養し、グリセロールストック及びプレート保存したいのですが、大腸菌と同じように、リストリークし生えてきたシングルコロニーを培養すればよいでしょうか。
酵母だと、注意しなければならない点はないでしょうか。ご教授いただけると幸いです。よろしくお願いいたします。

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