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(無題) 削除/引用 No.3080-24 - 2014/05/30 (金) 12:25:53 - seven 酸欠云々というのはフラスコに対して液量が多すぎるとかフタの密閉度が高すぎるとかの状態だとフラスコ内の酸素が消費されているかもと危惧しています。 測定スパンが短いとフタを開けることによるガス交換の頻度が高くなるので結果的に酸欠が抑えられているのではないかとの推測です。あくまで仮説ですが。 スパンが短いほうが増殖が悪い場合だと培養条件から室温、無撹拌状態においたことによる影響かもと疑いますが。

(無題) 削除/引用 No.3080-23 - 2014/05/30 (金) 09:19:49 - ~ 4時間目までで濁度に有意さが揃っていることを根拠に、それまでの工程がコントロールできていると考えたい点については分かりました。 それの妥当性はともかく、4時間目以降について、1時間おきに測る場合と、2時間おきに測る場合とでは、測定回数が異なりますよね。 測定回数が異なるということは、細かい操作は分かりませんが、サンプリングの回数が変わります。サンプリング時にどのくらいの時間がかかっているか分かりませんが、シェーカーは止めて一部を回収するか、フラスコごとを測定機にかけますよね。その間、フラスコは室温に曝され、また撹拌されませんので酸素分圧が低下します。 温度低下と酸素分圧低下は菌体生育にマイナスに働きます。 そのため、1時間おきに測定している方が有意にODが低いのであれば、その影響を見ていると考えることができます。

(無題) 削除/引用 No.3080-22 - 2014/05/30 (金) 07:42:36 - gg 上手く意図が伝わっていなかったのですが、初期菌数が多いという意味は最初に培養を始める菌数が多ければ、死滅期に入るのも早いという意味です。 実際、6時間後の吸光度の値が4時間後よりも下がってきているのであれば、安定期か死滅期に移行していると考えるのが妥当です。 他の方も指摘していますが、回収する際に培養器からフラスコを取り出し、サンプルを回収し、再び培養器まで戻すわけですよね。その操作にどのくらい時間がかかるかにもよりますが、培養を継続した場合と比較して菌に影響があってもおかしくはないです。

(無題) 削除/引用 No.3080-21 - 2014/05/30 (金) 05:39:37 - キキ 便乗質問させてください。 テトラサイクリン抵抗性の大腸菌を培養しようとしていますが、研究室にテトラサイクリンがありませんでした。ドキシサイクリンならあるよ、と言われたのですが、大腸菌の培養の際にドキシサイクリンで代用可能なのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3080-20 - 2014/05/30 (金) 02:05:29 - ｃDNA 研究のコンセプトが分からないので、的外れ化もしれませんが、大腸菌の培養としては少し普通じゃないことをしていると思います。 前培養の試験管で37度、110rpm、24時間 試験管は立ててますか？傾けてますか？ 24時間はかなり長いですよね。110rpmで24時間培養だと菌体は結構沈んでるのではないかと思いますが、そこから培養を初めて再現性の高い実験が出来る気がしません（経験的には）。 吸光度ではなく濁度(OD)と呼んだいいと思いますが、スタートが0.02、0.03というのは大きい値ですね。私はタンパク質の発現にしか大腸菌は培養しませんが、OD＝0.005から始めます。その方が良いか悪いかとは言いにくいのですが、0.02から初めて37度培養だと、5分のずれでもデータに影響しませんか？結構難しい実験だと思いますが。 前培養の時間だと対数増殖期ははるかに過ぎていますよね。前培養でどのような状況から本培養を始めるかで、増殖速度は思いのほか変化します。24時間も培養したものだとある日の24時間と別の日の24時間でもそこにいる菌の状態が同じかどうか、怪しいです。 こういう指摘に対しても「t検定で」とか、先輩の実験結果もそうだった、と言われると違いが出ることが真実なのかもしれないですね。ただ、6時間までしか培養していないのも不思議です。もっと長く見たらどうでしょうか。 経験的には調製後に複数のフラスコに分けてオートクレーブした培地に同じ前培養から分けて一緒に培養すると、全部がほとんど同じODになることもあれば、ならないこともあります。実験が下手なのかもしれませんが。 培養開始時のODは示してくれましたが、6時間でのOD値はどうでしょうか？0.5の違いと言われても値そのものを聞くと印象が変わるかもしれません。 いっそのこと測定データをすべて示してくれるとまた違う意見をもらえるかもしれないですよ。

(無題) 削除/引用 No.3080-19 - 2014/05/30 (金) 01:58:59 - おお 一つ一つの操作において、コンタミの危険性が0ではないでしょうということをいいたいのです。

回答 削除/引用 No.3080-18 - 2014/05/30 (金) 01:34:23 - kuroiti -おおさん 確かに断定はできません。しかし、寒天培地も同じクリーンベンチを使って植え継ぎをしているので、コンタミしているのであればその時点でコンタミしていると思います。 コロニーもできていない以上、コンタミしているとは今のところは考えておりません。

(無題) 削除/引用 No.3080-17 - 2014/05/30 (金) 00:13:01 - おお 滅菌操作をしているのでコンタミしてない。。。さあどうでしょうか。コンタミしているかどうかしらべてみて初めてコンタミしてないといえるのでは。

回答続き 削除/引用 No.3080-16 - 2014/05/29 (木) 22:44:44 - kuroiti -APさん 培養時間と吸光度の対数というのは自然対数のことですよね？4時間目までのプロットと直線の関係ですが、6時間目を入れると直線より下になっていました。 この場合は、どちらにバイアスがかかっているのでしょう？ あと、２つの対数値を比較しても大きく速度が違っているということはありませんでした。 吸光度測定するときの培養液は、エタノールで消毒したバランスディッシュの半分くらいの量をとって、そこからピペッティングをしてセルに移しています。 クリーンベンチ内で行っているので、コンタミをしているとは考えにくいのですが・・・。 その際は、フラスコの外側もエタノールで消毒し、バランスディッシュにとる際は、口を一度火炎滅菌して少し冷ましてから入れるようにしています。とったあとも、口に菌が付着しているので火炎滅菌しています。 用語のご指摘ありがとうございます。気を付けていきます。 -よっしーさん まったくの初心者ではあります。この実験も、先輩に教わったことを同じように行っているものなので。 コロニーカウントは、1 mlの溶液中にコロニーを作る菌がどのくらいいるかということですよね？ 吸光度だと生菌数も死菌数も測っているので、コロニーカウントでわかるものなのでしょうか？ まだその作業は行っていないのでやりたいとは思います。自分の経験値を上げるという意味合いに関しては。 未熟者なので、いろいろと皆さんのご意見は参考になります。 もう少し意見を募集したいと思いますので、何かありましたらまたいろいろとご教授願いたいと思います。

回答 削除/引用 No.3080-15 - 2014/05/29 (木) 22:37:18 - kuroiti ご回答ありがとうございます。 早速ですが返答させていただきます。 -ggさん 残念ながら、片方のデータは6時間後までのデータしかないので、その後の吸光度の値がわかっていません。 しかし、対数増殖期は吸光度の値を自然対数値に直したとき、直線にのらずR2値も低かったので対数増殖期ではないと思います。 過去のデータからも6時間後が対数増殖期ではないという結果が出ています。 初期菌数のほうが多いと早く増殖する可能性というのは考えにくいと思います。 参考までに、初期菌数の吸光度の値ですが、2時間のものが0.0245、1時間のものが0.0315という値が出ています。 仮にその仮説が正しければ、1時間のほうが早く増殖することになります。 -おおさん いろいろとご指摘ありがとうございます。 確かに有意性うんぬんは、サンプルに差があるどうこうを言うには早計かもしれません。しかし、菌株が変われば増殖挙動は違うように思われます。 そこには確かな有意差もあるのではないかと思われます。そう考えたうえで、有意差がない＝サンプルに差がないと思った次第です。 おおさんの意見もふまえ、もう少し考えてみます。 また、おおさんのいう「厳密」という条件の度合いですが、確かにおおさんの求めてるほどの厳密性には疎かになっている部分があると思います。 もう1度実験を行うにしても、条件を出来る限り同じにしてやってみないと何とも言えないのも事実です。 クローンということですが、別にDNAのほうまで解析は行っていません。あくまで同じ菌株という扱いで実験を行っていますので、もしかしたら突然変異したのかもしれません。 菌株自体は、同じクローンから植え継ぎで培養しているので、突然変異が起こらない限りは同じクローンであると考えています。 うちの研究室は、DNAを解析するという機会が滅多にないのでそれについては考慮していませんでした。少し参考にしてみます。 -sevenさん 酸欠というとこは、培養液中の溶存酸素濃度が2時間の方が早く消費されているということでしょうか？ そうすると2時間の方が早く酸素を消費する要因というのはどういうことが考えられるのでしょう？ 何か知っていることがあれば教えていただけたら幸いです。 今の自分としては、代謝効率がよくなるなどを考えてはいますが・・・。 今度実験する際は、前培養液を同じものを使って測定してみます。

(無題) 削除/引用 No.3080-14 - 2014/05/29 (木) 18:29:29 - AP あと、6時間目で急に大きな差が出たようにいうけれど、最初から増殖速度が違っていて、しかし測定値（菌数）が小さいために差の値も小さくなって目立たなかっただけという可能性も排除できないのでは？そういう検証の為にもプロットをとってみるべき。

(無題) 削除/引用 No.3080-13 - 2014/05/29 (木) 18:07:59 - よっしー どうやら初心者の様ですので，一度1時間毎のフラスコと2時間毎のフラスコの吸光度を測る際に，段階希釈してCFUを測定してみてはどうですか？ 練習にもなりますし，原因が分かるかもしれません． 種菌の生菌数の違いやコンタミの有無，あるいは対数増殖期，定常期など勉強になることが沢山あると思います．

(無題) 削除/引用 No.3080-12 - 2014/05/29 (木) 16:00:34 - AP 培養時間と吸光度（菌数）の対数のプロットはどうなりますか。 たとえば、4時間までの測定値のプロットの直線上に6時間目の測定値が乗るでしょうか。6時間目のプロットが直線より上にズレているか、下にずれているかで、どちらの群の増殖にバイアスがかかっているかわかるかも。 頻繁に栓を開けてピペットを突っ込んだほうがコンタミして濁りが早くなったとか？ >測定誤差なのかなと思ったのですが、t検定を行ったところ両側検定の結果で0.05より低い値が得られ、有意性があるということでした。 有意差（「有意性」というのは誤用）があるから、その差は測定誤差ではないというのも、間違った理解をしている。

(無題) 削除/引用 No.3080-11 - 2014/05/29 (木) 15:30:44 - seven スパンが短いほうが増殖が良いとのことなのでフラスコ中が酸欠になっている可能性があるのでは？ 皆さん言われていますが比較したい条件以外はサンプル間で同一にしたほうがよいです。大量培養時の差を見たいのなら前培養は同コロニー＆チューブのものを分注して使用するなどしたほうが実験としてシンプルでわかりやすいです。

(無題) 削除/引用 No.3080-10 - 2014/05/29 (木) 14:47:39 - おお たとえばgrowthでちょうどいい時間を探すのにまずは細かくtime courseをとってどれぐらいの時間で自分の都合のよいポピュレーションになるかしらべて、その後はそのデーターをもとに何時間培養して、菌体をあつめて実験するとかきめたりします。サンプリングの間隔が違うだけでデーターがかわれば、そう言う細かいtime courseは当てにならないはず。 もちろん毎回のぶれもあると思うので大まかにODを確認しながら培養することはあるとはおもいますけど。

(無題) 削除/引用 No.3080-9 - 2014/05/29 (木) 14:40:30 - おお 有意差がでなかった=サンプル間に差がないと言う解釈はまちがえですよ。 三連ではかったというのは同じフラスコから三回とったということ? >４時間目までは同じ増殖挙動を示していたのですが、６時間目に吸光度を測定したところ0.5くらいの差が出ました。 厳密に培養条件がそろっていれば差はでません。 4時間までは低い値で誤差に飲まれて差が見いだせなかったということかもしれません。 違う日にやっているとか、コロニーもちがうとか書いてますが、一回の実験で何個フラスコを用意して、それに同じクローンから拾ったのを移したのか違うクローンから入れたのかなど詳細がかかれてないので、何を比べたかもあやふやです。

(無題) 削除/引用 No.3080-8 - 2014/05/29 (木) 14:32:55 - gg 6時間後でもまだ対数増殖期であることは確認できてますか？ 初期の菌数が多い場合の仮説ですが、2時間毎に測定した場合の方が順調に生育して6時間後では死滅期にはいってしまった可能性は？

意見・質問の回答 削除/引用 No.3080-7 - 2014/05/29 (木) 14:00:45 - kuroiti 早速のご回答ありがとうございます。 質問の内容にできる限りで答えさせていただきます。 -おおさん 確かに、実験も違う日に行っているので菌数に差が出るとは思います。コロニーも違うものを使用しています。 しかし、t検定で有意性がなかったことを考慮するとその菌数の差は深く考えなくてもいいのではないかと思います。 今度実験を行う際は、最初の菌数を揃えるような実験をしたいと思います。 測定スパンに関してですが、これは測定間隔のことを指しています。簡単にいえば1時間毎、2時間毎ということです。 -~さん 実験日が違うので、複数のフラスコと解釈していただいて構いません。 半分というのは作製した培地のことを言っているのでしょうか？これは、違う日に実験しているので、実験の度に新しいLB培地を作って実験をしています。 前培養終了時の菌数の幅、本培養時の菌体増殖の幅はt検定では有意性がないということで、再現性がとれていると考えています。その6時間目だけが有意性があるという結果なので。 吸光度測定時のエアレーションというのはどういうことを指しているのでしょうか？勉強不足で申し訳ありません。 温度の影響ですが、吸光度測定時は培養室から室温に取り出しているので、多少は下がると思いますが、液体自体もともと下がりにくいものなので生育に影響が出るほどの温度変化はないのではと考えています。 自分自身この実験はまだ回数をこなしていないので、再現性がとれているとは言えないかもしれませんが、過去の先輩たちのデータで同じような結果が得られているので、再現性が高いのではないかと考えています。 -Harmoniaさん t検定を行ったのは先生のアドバイスのもと行いました。6時間目のところで明らかに有意性があるのかどうかということを確かめるために行いました。 3連で吸光度測定し、その平均値を使ってt検定を行っています。 -波平さん 1時間の方が高い値を出しています。過去の先輩たちのデータでも、測定スパンを短くすると吸光度が高くなるというデータがありました。 振盪装置は、他の研究室と共用の振盪装置を使っているので、置く場所は違ったりしますが、そこまで大きく差が出るものなら過去のデータと比較しても大きくバラつきが出るのではないかと思います。 フラスコもまったく同じものを使っているわけではありません。あくまで、同じ道具を使っているというだけです。 -NMさん 測定器具の違いについて誤差が生じるのは考慮していますが、それならもっと早い段階で誤差が生じてもいいのではないでしょうか？ それにそこまで大きな誤差が出る器具なら、メーカー側にも問題があるように思えます。 とりあえず、質問の回答は以上です。また何かご意見がありましたらよろしくお願いいたします。

(無題) 削除/引用 No.3080-6 - 2014/05/29 (木) 11:10:05 - NM 坂口フラスコもバッフル付き三角フラスコも手作りなので形が異なります。 以前、大きいラボにいたときは数ある三角フラスコから同じ形状のものを選別して使っていました。 他の方も指摘されているように、測定のときに温度の低下とエアレーションが止まることも影響が大きいと思います。培養のマニュアルに、吸光度をチェックするときは毎回同じフラスコを使いましょうと書かれているのもそれが理由かと。

(無題) 削除/引用 No.3080-5 - 2014/05/29 (木) 08:31:48 - 波平 1時間と2時間でどちらが高いのでしょうか？ フラスコを培養器から取り出して，クリーンベンチで再度戻すまで，フラスコは震とうされていませんし，温度も37℃になっていないと思いますが。 1時間の方が取り出す回数が多いので，その影響を受けやすいです。 なので2時間の方が，ODが高いということはないでしょうか。 あと，震とう装置での置く位置やフラスコの違いも影響することはあります。

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