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(無題) 削除/引用 No.3079-9 - 2014/05/31 (土) 01:12:03 - おお >[Re:8] sinnmaimaiさんは書きました : > おおさん、アドバイスありがとうございます。 > お伺いしたいのですが、 > これらを探る実験方法は、ウェスタンブロットに関する文献で調べることはできるのでしょうか？ > 初心者で分からないことだらけでお恥ずかしいです・・・。 抗体のデーターシートなどからどの部分を抗原として使っているか、またはエピトープマッピングがされているかを確認してください。 > > とのことでしたが、細胞Xのコントロール細胞で目的タンパクを検出できていても、検討する必要があるのでしょうか？ たとえば抗体がC末で作られていて、その遺伝子の過剰発現のためスプライシングパターンがかわり、C末が違う配列になっていたら検出ができなくなりますよね。

(無題) 削除/引用 No.3079-8 - 2014/05/29 (木) 19:01:01 - sinnmaimai おおさん、アドバイスありがとうございます。 お伺いしたいのですが、 > または、その制御を担うターゲットのmRNA上のcis elementを探るとか。 > > いちおうそのターゲットの蛋白のmRNAがalternative splicingにより生じたものがあなたの抗体で検出できないとかそんな可能性も見ておいた方がいいんじゃないかな。 > > それと抗体のエピトープの領域が修飾受けるために検出できなくなっている可能性とかも。 これらを探る実験方法は、ウェスタンブロットに関する文献で調べることはできるのでしょうか？ 初心者で分からないことだらけでお恥ずかしいです・・・。 それから、 > いちおうそのターゲットの蛋白のmRNAがalternative splicingにより生じたものがあなたの抗体で検出できない > それと抗体のエピトープの領域が修飾受けるために検出できなくなっている可能性 とのことでしたが、細胞Xのコントロール細胞で目的タンパクを検出できていても、検討する必要があるのでしょうか？

(無題) 削除/引用 No.3079-7 - 2014/05/29 (木) 13:00:42 - おお 細胞Xとオリジナルの細胞で、蛋白をとったときと同じ培養条件でG1 S G2/M分布が変わっているかを調べるというやり方もあるかもしれません。 >[Re:6] tannpakuさんは書きました : > それぞれの定量PCRとウェスタンの結果は、 > 定量PCR・どちらも目的の遺伝子a（細胞周期関連因子）の発現を確認 > 　　　　　発現量は同程度でした > ウェスタン・コントロール細胞（遺伝子操作をしていない細胞X）のみ目的タンパクのバンドを確認 post-transcriptionalな制御がかかわっているようですね。細胞周期でその様な制御がかかっている例をさぐれば(たぶんいろいろキャラクタライズされているとおもう)実験系が思いつくのでは? または、その制御を担うターゲットのmRNA上のcis elementを探るとか。 いちおうそのターゲットの蛋白のmRNAがalternative splicingにより生じたものがあなたの抗体で検出できないとかそんな可能性も見ておいた方がいいんじゃないかな。 それと抗体のエピトープの領域が修飾受けるために検出できなくなっている可能性とかも。 > また、過剰発現させた遺伝子が細胞周期に影響している感覚があるので、 とおっしゃっている感覚って突き詰めるとなんでしょうか。それが明確になるなら実験が組みやすいのでは。

補足です 削除/引用 No.3079-6 - 2014/05/29 (木) 10:49:29 - tannpaku みなさん、色々なアドバイスありがとうございます。 私の質問に、情報が不足しているようでしたので、補足させていただきます。 まず、細胞Xは、過剰発現させた遺伝子、タンパクともに発現が高いのを確認しております。 ウェスタンブロットを行う際には、コントロールとして細胞Xの遺伝子操作をしていない親株もいれました。 それぞれの定量PCRとウェスタンの結果は、 定量PCR・どちらも目的の遺伝子a（細胞周期関連因子）の発現を確認 　　　　　発現量は同程度でした ウェスタン・コントロール細胞（遺伝子操作をしていない細胞X）のみ目的タンパクのバンドを確認 コントロール細胞でバンドが確認できたことから、実験系の問題ではないと考えております。 また、過剰発現させた遺伝子が細胞周期に影響している感覚があるので、目的タンパクが遺伝子操作した細胞では確認できないことをしっかりと証明したいと考えております。

(無題) 削除/引用 No.3079-5 - 2014/05/28 (水) 22:27:05 - おお そもそも過剰発現をさせてない状態と比べてその遺伝子や遺伝子産物の発現が変わっているんでしょうか。変わってなければその系で細胞周期によってあなたのtarget geneの発現が制御されているという仮説も立てられないのではないでしょうか。 もし変わっているなら、細胞Xでなくってオリジナルの細胞であるいは細胞周期実験がしやすい(G1アレストとか)細胞で発現の細胞周期依存性などを見るのもありえるアプローチかもしれません。

(無題) 削除/引用 No.3079-4 - 2014/05/28 (水) 21:02:01 - 名無し 自分ならばとりあえず細胞周期を同調させて培養（同調培養）して、経時的にサンプリングして細胞回収してウェスタンするとおもう たいていの細胞は細胞周期一周りするのにたぶん15~25時間くらいとおもうので、３〜5時間おきくらいかな。もし夜中の実験を避けたいならば、ちょっと面倒だけど実験を２回／２つに分けてもいいとおもう。 で、どの辺で出現するか当たりがついたら、細胞周期のマーカー蛋白質のウェスタンも加えたりとか、細胞の免疫蛍光染色とかFACSとかも導入するとか、もうすこし詳細な実験を追加していけばいいとおもう。 細胞周期同調法はすでに確立した方法がいくつかあるので成書を参照してほしい。一番金かからない簡単な方法はフラスコを強く叩いて、分裂期で丸くなった細胞を選択的に剥がして浮かせて回収する方法がある。得られる細胞数が多くないのが欠点だけど。

(無題) 削除/引用 No.3079-3 - 2014/05/28 (水) 19:27:01 - ~ まず、現時点のサンプルと実験操作から得られた結果について、どのような仮説を持っているのでしょうか？ ・タンパク質Aはサンプル中に存在しているが、検出できていない →検出系に問題がある →検出系の妥当性評価として、ポジコン、ネガコンのデータを取る ・遺伝子AのmRNAはあるが、タンパク質はほとんどない ・・そればある遺伝子の過剰発現とは無関係に起きている →→ある遺伝子を過剰発現させていない親株でもタンパク質Aが検出されないことを確認する ・・ある遺伝子の過剰発現により起きている →→ある遺伝子を過剰発現させていない親株ではタンパク質Aが検出されるかを確認する ・・特定の細胞周期の時点でなければタンパク質がない →→細胞周期を同調させ、高発現の条件で検出できるかを確認する >その時の細胞の状態にも左右されるのかと考えました。 考えるための知識として、遺伝子aの発現について解析した論文は一通り読みましたよね？ 細胞周期関連遺伝子とまで分かっているのに、これまでにタンパク質が検出されたことがない、というものはそうそうないと思います。

(無題) 削除/引用 No.3079-2 - 2014/05/28 (水) 18:49:57 - qw 遺伝子aの高発現する組織、条件を探す。NCBIのGEO-profileをスマートかつ丹念に探せば良いです。 細胞周期関連であれば、こんな所も見ておくと良いかもしれません。 http://genome-www.stanford.edu/Human-CellCycle/Hela/search.shtml ウェスタンで出ないときに、抗体がヘタれの可能性もあるので、ポジコンがぜひ欲しいです。しかし、組み換えタンパクをどっかり載せたのでは、ポジコンと呼べるか怪しいので、高発現する組織や条件（例えば、細胞周期を途中で止めちゃうとか）を探すとよいです。 そうは言っても、遺伝子発現の結果とウェスタンの結果が一致するわけではないのが悩ましいですね。 ウェスタンで細胞Xの親株（過剰発現していない細胞）も確認しないと判らんよね。ここもコントロールをちゃんと取りましょうということ。

タンパク（細胞周期関連）の解析方法 削除/引用 No.3079-1 - 2014/05/28 (水) 18:25:54 - tannpaku こんにちは。 大学院修士課程に所属するものです。 自分で実験を計画しようとしているのですが、何分まだ研究初心者なので、分からないことだらけで困っております。 細胞Xは、通常の状態では定量PCRにより遺伝子aの発現が確認されています。 しかし、ウェスタンブロットでタンパクの発現を確認したところ、バンドをえることができませんでした。 この遺伝子aは細胞周期関連の因子です。なので、その時の細胞の状態にも左右されるのかと考えました。 細胞周期関連のタンパクの発現を確認する際、気をつけるべきことなど、何かアドバイスありましたら教えていただきたいです。 また、細胞Xは遺伝子操作により、ある遺伝子を過剰発現させた状態なので、その影響で遺伝子aのタンパク合成を阻害orタンパクを破壊している可能性も考えています。 このことを検討するためにどのような実験をやるべきか、色々と勉強してはいますが、悩んでいます。 指導員の方は海外の学会でいないので、その間に計画だけでも立てたいと思っています。 参考文献でもいいので、なにかアドバイスお願いいたします。

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