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(無題) 削除/引用 No.3078-13 - 2014/05/31 (土) 01:05:31 - おお >[Re:11] TSさんは書きました : > みさん、えーさん： > > あ、そうですね。IgGはそのくらいになりますね、確かに。 > 目的タンパク質が非還元化でどこに出るかは今のところ不明ですが、 > ウェスタンで検出できますので、試してみればわかります。 非還元でバンドの挙動が違う場合(IgGと重ならない限り)、そのバンド領域を切り出して還元条件でもう一度流してみると目的のものかどうか検証できると、先の回答でコメントしました。

(無題) 削除/引用 No.3078-12 - 2014/05/31 (土) 01:01:38 - おお >[Re:7] 愛費さんは書きました : > >IPする前に変性させて、非変性条件にもどしてからIPするとcomplexesを広う可能性がひくくなる。 > > ノンスペ増えません？ ノンスペについてはそれぞれの実験条件次第とおもいます。RIPA(0.1%SDS入り)でIPできるなら今のところまあ問題になってません(MSに持っていったことはなくIP westernでコバレントな結合などみる限りでは)。 ユビキチン化を見る実験や、Chip assayでもしばし使われる方法です。

(無題) 削除/引用 No.3078-11 - 2014/05/29 (木) 11:56:26 - TS みさん、えーさん： あ、そうですね。IgGはそのくらいになりますね、確かに。 目的タンパク質が非還元化でどこに出るかは今のところ不明ですが、 ウェスタンで検出できますので、試してみればわかります。 来週くらいには時間が取れるかもしれないのでやってみます。 ありがとうございます。

(無題) 削除/引用 No.3078-10 - 2014/05/29 (木) 11:51:06 - えー >[Re:9] みさんは書きました : > IgGは非還元でboilしたら170kDaくらいに泳動されるよね。 > heavy chain２本とLight chain２本がS-Sでつながっているのだから。 IgGはその通りなんだけど、目的のタンパク質が不明ということは、非還元条件だとどんな状態かわからないから、どのバンドかわからなくなるんじゃないかな。 1種類のタンパク質だけなら問題ないけどね。

(無題) 削除/引用 No.3078-9 - 2014/05/29 (木) 11:22:41 - み IgGは非還元でboilしたら170kDaくらいに泳動されるよね。 heavy chain２本とLight chain２本がS-Sでつながっているのだから。

(無題) 削除/引用 No.3078-8 - 2014/05/29 (木) 10:08:23 - TS みなさま、多くのご助言ありがとうございました。 複数の異なる対処方法を知ることができて、 全く考えていなかったこともあったので、大変勉強になります。 monさん： ありがとうございます。私も少し考えておりました。 サンプルバッファーに溶出をどのくらい防げるのかなぁと考えておりましたが、 かなり減りそうですね。検討いたします。 〜さん： 2Dは経験豊富ではないのですが、サンプルバッファーでの溶出は2Dには不向きですよね。エピトープについては、業者に問い合わせたところ、ざっくりとしたペプチド範囲は教えてくれるのですが、Specificには教えられない、と言われてしまいました。 名無しさん： おっしゃる通りで、多少のIgGのコンタミは大丈夫と思っています。でも、丸かぶりだと、さすがに同定率が落ちるかなぁと。落ちないんでしょうか？？ monさんもご提案していただいていましたが、ビーズと抗体の共有結合については積極的に考えていきたいと思います。ありがとうございました。 みさん: この場合、IP後のビーズからの溶出は、b-MEを除いたサンプルバッファーということですか？　 ちょっと経験ないのですが、分子量の同じIgGと目的タンパク質でもその移動度は、大きく変わってくるかものですか。そのタンパク質がどのくらいS-S結合を持つか次第、あるいは、IgGを非還元条件で流すと、かなり移動度が変わるという情報をご存知でしょうか。ワークすれば、簡単に問題解決できそうです。検討してみます。ありがとうございました。 おおさん： ありがとうございます。わたしも、皆さんの提案にそれぞれ試す価値がありそうに思いました。あまり考えるよりも手を動かします。 私の実験技術や、研究環境などを総合的に考えると、 ・抗体の共有結合・・・２Dしなくてすみそうだし。 ・非還元条件での泳動・・・うまくワークすれば、一番簡単？ あたりから、積極的に検討しようかと思います。

(無題) 削除/引用 No.3078-7 - 2014/05/29 (木) 07:54:45 - 愛費 >IPする前に変性させて、非変性条件にもどしてからIPするとcomplexesを広う可能性がひくくなる。 ノンスペ増えません？

(無題) 削除/引用 No.3078-6 - 2014/05/29 (木) 00:40:02 - おお IgGでIPしたものをそのままLC/MSに持っていけばIgGペプチドは分離されるので、immunocomplexesの蛋白も引っかかるはず。問題はそのcomplexのコンポーネント(間接的)なのか、直接くっついてきたかということ。IPする前に変性させて、非変性条件にもどしてからIPするとcomplexesを広う可能性がひくくなる。 IPするかしないかはともかく、2Dでスポットとして得られるのであればそこから切り出せばいいかとおもいます。 IgGを支持体にクロスリンクさせてしまってIgGが溶出しないようにするてもありますね。 非還元でSDSPAGEするのも、バンドが得られるならそれも可だとおもいます。非還元状態と還元状態でバンドの対比がちゃんととれるなら。まあ切り出して還元状態で流して確認すればいいわけですけど。

(無題) 削除/引用 No.3078-5 - 2014/05/28 (水) 23:11:55 - み 非還元で泳動

(無題) 削除/引用 No.3078-4 - 2014/05/28 (水) 20:13:52 - 名無し あんまり詳しくないですが、LC-MS/MSならばたとえIgG混じっていても抗原蛋白質の同定は可能とおもいます。ていうか実際出来てます。ただIgGがあまりに大量で、一方で抗原蛋白質がかなり微量の場合は同定に影響があるかもしれません。なんで、すでにやっているかもしれないですが、あらかじめビーズと抗体を架橋剤で共有結合で結合させたものをIPに使用すれば、溶出画分へのIgGの混入はかなり減らせます。（ただ現実には100%共有結合は無理みたいで多少はビーズから漏れて溶出画分に混じります。クマシーで薄く染まるくらい。）あとやっているとおもいますが、コントロールとしてnormal IgG―ビーズでのIPを並行して行い、当該部位のゲルを切り出してIPの方と同様に分析し、両者の結果を総合すれば目指す蛋白質が分かると思います。 IPであるていど精製できてるならゲル電気泳動とかしないで直接溶出画分をトリプシン消化してLC-MS/MSにかけてもいいとおもいます。

(無題) 削除/引用 No.3078-3 - 2014/05/28 (水) 19:20:49 - 〜 免疫沈降後でも２Dやればheavy chainのスポットとは分離できるのでは？ あるいはエピトープがわかっているんであれば、そのペプチドを使って溶出させるとか、、、効率悪そうだけど。

(無題) 削除/引用 No.3078-2 - 2014/05/28 (水) 16:57:10 - mon 非特異的結合の少ない親水性表面を有したマグネティックビーズに抗体を共有結合することをお勧めします。

免疫沈降サンプルのタンパク質同定 削除/引用 No.3078-1 - 2014/05/28 (水) 16:19:32 - TS いつも勉強させていただいております。 免疫沈降からLC-MS/MSによるタンパク質同定に進めたいと思っています。 この経緯は、用いている抗体が本来のターゲットは異なる他のタンパク質も認識しているような感触があり、それを同定してみたいと考えているためです。 しかしながら、SDS-pageにおいて、当該タンパク質は50kDa付近に検出されるため、IgG-Heavy chainと被ると思われ、ゲル切り出しで大量のIgG-HCが混じってしまいそうです。 このような場合、IgG-HCが混じらないようにできる方法はありますでしょうか。 あるいは、免疫沈降なしで二次元電気泳動を行い、スポットを切り出すべきでしょうか。 よろしくお願いします。

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