Bio Technical フォーラム

  • バイオ関連の実験をする上での、試薬、機器、プロトコールなどの情報交換の場です。
  • 新しいテーマで話を始める場合、質問をする場合は「新しいトピックを作る」から書き込みをしてください。
  • 質問に対して解答できる方は是非、書き込んで下さい。
  • このフォーラムにふさわしくないと管理人が判断した投稿は予告なく削除します。

新しいトピックを作る　|　トピック一覧　|　研究留学ネットに戻る

ひとつ前のフォーラム（readのみ）

このスレッドをはてなブックマークに追加このスレッドをはてなブックマークに追加

大腸菌について教えてください。 トピック削除
No.3077-TOPIC - 2014/05/28 (水) 09:53:27 - E.Coli
大腸菌のgenotypeに関して、一点わからない点があります。

現在pCDM8のmammalian expression vectorを使ってプラスミドの構築を計画しています。

このpCDM8それ自身には選択用の薬剤抵抗性遺伝子は搭載されておりません。その代わり、SupF+であるため、P3 episomeを持つ大腸菌内（MC1061/P3やTOP10/P3など）で形質転換が起これば、それらはTet, Ampそれぞれに抵抗性を獲得します。


随分前にgenotypeも理解せず大腸菌を扱っていた時期があり、その当時pCDM8を特に何も考えずDH5αに形質転換していました。（この際、きちんと大腸菌は増え、正しいプラスミドも回収されました。）

今思えばDH5αはP3 negativeのはずなのですが、なぜAmpで選択がかかったのか不思議でなりません。これはどのようにして理解したら良いでしょうか？
DH5αにもP3のような薬剤抵抗性遺伝子にamber変異を持つようなものが入っているのでしょうか？

大変稚拙な質問で恐縮ですが、どうかご教示いただけますと幸いです。
　
- このトピックにメッセージを投稿する -



全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

(無題) 削除/引用
No.3077-11 - 2014/05/28 (水) 15:53:25 - 中年
昔は大腸菌の形質転換効率も高くなかったので、ベクターのサイズをなるべく小さくしようとしてこういうトリックが使われたのだと思いますが、今となってはあえてpCDM8を使うメリットはほとんどないのではないでしょうか。pcDNA3でも、コピー数を落としたければpcDNA1/Ampでも、Amp耐性の使い易いベクターを使えば良いように思います。

(無題) 削除/引用
No.3077-10 - 2014/05/28 (水) 14:15:47 - E.Coli
おお様

そんなに眼て見てわかるほどなんですね。
確認してみます。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.3077-9 - 2014/05/28 (水) 14:14:10 - E.Coli
AP様、中年様

なるほど！！大変良く分かりました。確かにP3とpCDM8は異なるoriでした！！
すごくすっきりしましたありがとうございましたm(_ _)m

今手持ちのpCDM8を増やす分に関してはDH5alphaで再度調製可能だとしても、今後、ここにインサートをクローニングするとなると（制限酵素配列を両端に持ったアンプリコンと、制限酵素処理したpCDM8をライゲーション）、酵素処理後のゲルから切り出しサンプルにはP3は混入してこなくなる可能性大ですね。

そうなると、ligationし終えたサンプルの形質転換はP3を持つ大腸菌でやらないと生えてこない可能性が大ということになりますね。今、手持ちにP3+の大腸菌がありませんので、（買えばいいのですが）困りましたね。ですが大変勉強になりました。ありがとうございます。

(無題) 削除/引用
No.3077-8 - 2014/05/28 (水) 14:07:51 - おお
じっさいMC1061/P3からprepしたpCDM8バックボーンのプラスミドにP3が混入しているのはエチブロでも確認できることもよくあります。そんなに大きくないから一緒に取れてくるんでしょうね。

(無題) 削除/引用
No.3077-7 - 2014/05/28 (水) 13:47:36 - 中年
増やすプラスミドにも依ると思いますが、泳動するとP3のバンドも結構はっきり見えますよね。

(無題) 削除/引用
No.3077-6 - 2014/05/28 (水) 13:36:43 - AP
そうだとすると、F-のDH5alphaだったからというのもミソだったかも。
JM109やXL1-blue F'のようなF'+けいとうだと生えなかったかも。

(無題) 削除/引用
No.3077-5 - 2014/05/28 (水) 13:15:57 - AP
>つまり、元々のMC1061/P3からprepしたpCDM8プラスミドにP3が少量混入していた、ということですね？

ありえる。

>ん？？でも、基本的にコンピテント大腸菌にはたった一つのプラスミドしか入らないではないでしょうか？

それは、oriが同種で同じ複製開始機構のレプリコンの場合。
oriが異なるなら共存可能。そうでなければ、F因子をもつ宿主菌にしてpUC系でクローニングをおこなうなんてことも出来ません。

確認したわけではないけれど、たぶんpCDM8のoriはpMB1系（pBR322系）でP3はF因子やP1と同系統ではないだろうか。

(無題) 削除/引用
No.3077-3 - 2014/05/28 (水) 12:42:46 - E.Coli
おお様

コメントありがとうございます。
以前のサンプルにP3が混入していた可能性ですか。。
それは全く考えていませんでした。

つまり、元々のMC1061/P3からprepしたpCDM8プラスミドにP3が少量混入していた、ということですね？確かにP3はepisomeという形をとりますので、自己複製可能ですよね。なるほど。。

やはりこの可能性が一番考えられますでしょうか。

ん？？でも、基本的にコンピテント大腸菌にはたった一つのプラスミドしか入らないではないでしょうか？そうなるとP3エピソームを保持しつつ形質転換というのも矛盾しますね？

(無題) 削除/引用
No.3077-2 - 2014/05/28 (水) 10:12:21 - おお
そのプラスミドにP3が混入してたのでしょう。

大腸菌について教えてください。 削除/引用
No.3077-1 - 2014/05/28 (水) 09:53:27 - E.Coli
大腸菌のgenotypeに関して、一点わからない点があります。

現在pCDM8のmammalian expression vectorを使ってプラスミドの構築を計画しています。

このpCDM8それ自身には選択用の薬剤抵抗性遺伝子は搭載されておりません。その代わり、SupF+であるため、P3 episomeを持つ大腸菌内（MC1061/P3やTOP10/P3など）で形質転換が起これば、それらはTet, Ampそれぞれに抵抗性を獲得します。


随分前にgenotypeも理解せず大腸菌を扱っていた時期があり、その当時pCDM8を特に何も考えずDH5αに形質転換していました。（この際、きちんと大腸菌は増え、正しいプラスミドも回収されました。）

今思えばDH5αはP3 negativeのはずなのですが、なぜAmpで選択がかかったのか不思議でなりません。これはどのようにして理解したら良いでしょうか？
DH5αにもP3のような薬剤抵抗性遺伝子にamber変異を持つようなものが入っているのでしょうか？

大変稚拙な質問で恐縮ですが、どうかご教示いただけますと幸いです。
全10件 ( 1 〜 10 )　 前 | 次 　1/ 1. /1

パスワードを入力してチェックした記事を チェックした記事を

このトピックにメッセージを投稿する
名前 
メール  　アドレス非公開
   タイトル 
本文      
設定  クッキーを保存（次回の入力の手間を省けます）
上に上げない（トピックの一覧で一番上に移動させません）
解決（問題が解決した際にチェックしてください）
暗証  半角英数字8-12文字の暗証番号を入れると、あとで削除、修正ができます。
送信 
〔使い方〕
  • 「アドレス非公開」をチェックすれば、自分のメールアドレスを公開しないで他の方からメールを受け取れます。
  • 問題が解決した際には、解決ボタンをチェックして解決した旨のコメントをつけてください。これは、初めにトピックを作った人と管理人のみが可能です。
  • 半角カタカナ、機種依存文字(全角ローマ数字、○の中の数字等)は文字化けの原因となりますので使わないでください。